Page 29 - 《中国药房》2023年14期
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一。现阶段，脑胶质瘤的临床治疗以手术为主，同时结                           号 9325）、兔源磷酸化 GSK-3β（p-GSK-3β）多克隆抗体
                    [3]
          合化学疗法 ，但手术无法完全根除病灶，化学疗法存在                         （批号 9336）、兔源 Akt 单克隆抗体（批号 4691）、兔源磷
          副作用大、易发生耐药等不足，使得相关治疗无法获得                           酸化 Akt（p-Akt）单克隆抗体（批号 4060）均购自美国
          理想效果，给患者家庭和社会造成了巨大负担。                              Cell Signaling Technology 公司；兔源 B 细胞淋巴瘤 2（B
              天然药物及其活性成分具有作用靶点多、长期使用                         cell lymphoma-2，Bcl-2）多克隆抗体（批号 GB113375）、
          副作用小等独特优势，故从中挖掘脑胶质瘤的潜在治疗                           兔源 Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）
          药物具有重要意义 。重楼皂苷Ⅵ（polyphyllin Ⅵ，PPⅥ）                 多克隆抗体（批号GB114122）、兔源β-肌动蛋白（β-actin）
                         [4]
          是从中药重楼中分离出的一种甾体皂苷类成分，对骨肉                           多克隆抗体（批号GB11001）、BCA蛋白定量检测试剂盒
            [5]
                         [7]
                                 [8]
                  [6]
                                                   [9]
          瘤 、肺癌 、肝癌 、食管癌 、急性髓性白血病 、结肠                       （批号G2026）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；凋
          癌 等肿瘤细胞的增殖、转移具有抑制作用，并可促进                           亡检测试剂盒（批号AP101-100）购自杭州联科生物技术
            [10]
                                                [11]
          上述细胞的凋亡，表现出良好的多靶点效应 ，可能是                           股份有限公司。
          一种潜在的多靶点抗癌药物。研究发现，PPⅥ可促进脑
                                                             1.3 细胞
          胶质瘤细胞的凋亡和自噬，其作用机制与激活 c-Jun 氨
                                                                 人脑胶质瘤 LN229 细胞（编号 BNCC341218）购自
          基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38丝裂原
                                                             北京北纳创联生物技术研究院。
          激活的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，      2 方法
                            [12]
          p38 MAPK）通路有关 。但脑胶质瘤作为高度特异性
                                                             2.1 细胞培养
          肿瘤必然受多种通路的调节，其中蛋白激酶 B（又称
                                                                 取人脑胶质瘤 LN229 细胞，接种于专用培养基中，
          Akt）/糖 原 合 成 激 酶 3β（glycogen  synthase  kinase-3β，
                                                             于 37 ℃、5%CO2条件（下同）下培养。每 2 d 更换 1 次培
          GSK-3β）信号通路和 Fas/Fas 配体（Fas ligand，FasL）死
                                                             养基，取对数生长期的细胞进行后续实验。
          亡受体通路与其发生、发展密切相关                [13―14] 。基于此，本
                                                             2.2 PPⅥⅥ对细胞增殖能力影响的检测
          研究以人脑胶质瘤细胞 LN229 为对象，并基于 Akt/
                                                                 取对数生长期的细胞，用培养基调整细胞密度至
          GSK-3β和Fas/FasL通路初步探讨PPⅥ抑制细胞增殖和
                                                                  4
                                                             5×10 个/mL，按 100 μL/孔接种于 96 孔板中，培养 24 h
          诱导细胞凋亡的潜在作用机制，为脑胶质瘤治疗药物的
                                                             后，将细胞分为空白组（不加细胞与药物，只加培养基）、
          开发提供理论依据。
                                                             对照组（0.1%DMSO+培养基）、不同浓度PPⅥ组（分别含
          1 材料
                                                             PPⅥ 1、2、4、8、16、32、64 μmol/L，浓度依据前期预实验
          1.1 主要仪器
                                                             结果和相关文献 设置），每组设 5 个复孔。分别培养
                                                                            [12]
              本研究所用主要仪器包括 BPN-80CRH 型 CO2细胞
                                                             24、48、72 h 后，弃去培养基，加入 0.5 mg/mL 的 MTT 溶
          培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），DYY-6D 型电泳
                                                             液100 μL，孵育4 h，按150 μL/孔加入DMSO，混匀。使
          仪（北京六一仪器有限公司），Attune NxT型流式细胞仪
                                                             用酶标仪于 490 nm 波长下测定每孔的吸光度（A）值并
         （美国 Beckman Coulter 公司），iBright FL1500 型化学发
                                                             按下式计算各组细胞的存活率：存活率（%）＝（实验组A
          光凝胶成像系统、Varioskan LUX 型多功能酶标仪[赛默
          飞世尔科技（中国）有限公司]、Eclipse 80i型倒置显微镜                   值－空白组 A 值）/（对照组 A 值－空白组 A 值）×100%；
         （日本Nikon公司）等。                                       同时，使用 GraphPad Prism 5.0 软件计算 PPⅥ的半数抑
          1.2 主要药品及试剂                                        制浓度（median inhibitory concentration，IC50 ）。
              PPⅥ对照品（批号 55916-51-3，纯度≥98%）购自成                2.3 PPⅥⅥ对细胞克隆形成能力影响的检测
          都德思特生物技术有限公司；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸                               取对数生长期的细胞，按500个/孔接种于6孔板中，
         （EDTA）消 化 液（批 号 9002-07-7）、伊 红 染 液（批 号              培养24 h。将细胞分为对照组和不同浓度PPⅥ组（分别
          G1100）、二甲基亚砜（DMSO，批号 D8371）、MTT 试剂                 含 PPⅥ 2、4、8 μmol/L，浓度参考“2.2”项下结果设置），
         （批号M8180）均购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血                         每组设3个复孔。每隔2 d更换1次培养基并重新给药。
          清（批号 C0232）购自美国 Gibco 公司；LN229 细胞专用                培养 14 d 后，弃去培养基，细胞用磷酸盐缓冲液清洗 3
          培养基（批号CM0578）购自武汉普诺赛生命科技有限公                        次，再用预冷的甲醇固定15 min；移除甲醇，加入0.1%结
          司；兔源切割的胱天蛋白酶 3（cleaved caspase-3）多克隆               晶紫染液染色 10 min；移除结晶紫染液，用水清洗 2 次，
          抗体（批号9661）、兔源cleaved caspase-8单克隆抗体（批              静置干燥后，使用显微镜对细胞克隆数（＞50个细胞）进
          号 9496）、兔源 FasL 单克隆抗体（批号 68405）、兔源 Fas             行记录，并按下式计算克隆形成率：克隆形成率（%）＝
          单克隆抗体（批号 4233）、兔源 GSK-3β 多克隆抗体（批                   克隆数/细胞接种数×100%。


          中国药房  2023年第34卷第14期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 14    · 1687 ·
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