Page 35 - 《中国药房》2023年14期
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2.2 Cur-SLN-FL的肺部刺激性研究                             变化。
              取大鼠 18 只，采用随机数字表法分为 3 组，即空气                    2.3.5 肺组织胶原纤维沉积情况的检测
          对照组、空白 SLN-FL 组和 Cur-SLN-FL 组，每组 6 只（5                 采用 Masson 染色进行检测。取固定于 4% 多聚甲
          只正式+1只备用）。空白SLN-FL组和Cur-SLN-FL组大                   醛的各组小鼠右肺组织适量，常规脱蜡至水，染色，冲
          鼠均采用大鼠干粉定量雾化器将吸入微粉按 50 mg/kg                       洗，吹干后，封片，于光学显微镜下观察各组小鼠肺组织
          经气管给药（依据单次雾化最大给药剂量，参考前期细                           胶原纤维沉积情况。
          胞毒性实验、细胞药效学实验结果设置），每日1次，连续                         2.3.6 肺组织中 NLRP3、caspase-1 和 IL-1β 阳性表达的
          7 d；空气对照组大鼠给予等体积空气。末次给药 24 h                       检测
          后，处死各组动物，迅速取出气管及肺组织，进行苏木                               采用免疫组织化学法进行检测。取各组小鼠左肺
          精-伊红（HE）病理检查。                                      组织，分离直径为 100 μm 左右的肺动脉，4% 多聚甲醛
          2.3 肺部吸入 Cur-SLN-FL 对 COPD 模型小鼠炎症反                 固定，石蜡包埋，制成厚度为 5 μm 的切片，免疫组织化
          应的实验研究                                             学染色；切片脱蜡，分别加入一抗 NLRP3、caspase-1、
          2.3.1 COPD动物模型的建立                                  IL-1β（稀释比例均为1∶200）后，4 ℃过夜，再分别加入相
              参照相关文献      [11―13] 并结合课题组前期预实验结果              应的二抗（稀释比例为 1∶200），脱水封片。在显微镜下
          采用气管内滴注猪胰蛋白酶（1 000 U/kg）复制COPD模                    观察 5 个不同视野中 NLRP3、caspase-1、IL-1β 的阳性细
          型：60 只小鼠经盐酸替来他明-盐酸唑拉西泮肌内注射                         胞数。
          50 mg/kg 麻醉后，固定于操作台上呈仰卧状态，从颈部                      2.3.7 肺组织中NLRP3、caspase-1和NF-κB蛋白表达的
          开始做皮肤消毒、备皮，切开皮肤、皮下组织，充分暴露                          检测
          气管后，选择5号针头插入气管内。其中随机选用12只                              采用 Western blot 法进行检测。取各组小鼠（5 只）
          小鼠按 1.0 mL/kg 注入生理盐水，其余小鼠均滴注猪胰                     新鲜肺组织适量，加RIPA蛋白裂解液于冰上研磨裂解，
          蛋白酶溶液（质量浓度为 33.3 mg/mL、给药剂量为 1.0                   在EP管中反复冻融，离心后取上清液，采用BCA蛋白浓
          mL/kg）。滴注完毕后，先消毒皮肤并缝合。小鼠苏醒后                        度测定试剂盒测定蛋白浓度，高温使蛋白变性。变性蛋
          24 h，无死亡，正常喂养28 d，待分组。                             白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至
          2.3.2 分组及给药                                        0.45 μm 聚偏二氟乙烯膜上，5% 脱脂奶粉封闭 1～2 h
              除“2.3.1”项下 12 只滴注生理盐水的小鼠作为假手                   后，分别加入一抗 NLRP3、caspase-1、NF-κB（稀释比例
          术组外，造模成功的模型小鼠按体重随机分为模型组、                           均为 1∶200），4 ℃振荡过夜；磷酸盐缓冲液洗涤 3 次后，
          布地奈德组（依据临床一次吸入的剂量换算成小鼠的                            分别加入相应的二抗（稀释比例为 1∶200），室温孵育 2
          剂量为 20 mg/kg）和 Cur-SLN-FL 高、低剂量组（100、50            h；加入 ECL 发光试剂显影，分析各蛋白条带的灰度值，
          mg/kg，参考前期预实验结果设置），每组 12 只（10 只正                   以β-actin为内参计算目的蛋白条带的相对比值。
          式+2只备用）。Cur-SLN-FL高、低剂量组小鼠均采用小                     2.4 统计学方法
          鼠干粉定量雾化器经气管给药；布地奈德组小鼠采用液                               采用GraphPad Prism 5.0软件和SPSS21.0软件对数
          体定量雾化器经气管给药；假手术组和模型组小鼠经气                           据进行统计分析。数据均以 x±s 表示。多组间比较采
          管给予等体积生理盐水，每日1次，连续14 d。                            用单因素方差分析，组间两两比较采用 Bonferroni 法检
          2.3.3 支气管肺泡灌洗液的白细胞分类计数                             验，检验水准α＝0.05。
              末次给药 24 h 后，处死小鼠，打开胸腔，暴露双肺，                    3 结果
          取出右肺（每组6只），暴露气管，在气管下段作小T形切                         3.1 Cur-SLN-FL粒径和载药量的检测结果
          口，插入钝钢针头，手术线固定，注射器注入 8 mL 生理                           经测定，Cur-SLN-FL 的平均粒径为（4.95±0.57）
          盐水，反复抽吸 3 次回收支气管肺泡灌洗液（bronchoal‐                   μm、空气动力学粒径为（4.03±0.40）μm，在 1～5 μm 的
          veolar lavage fluid，BALF），收集 BALF 5～8 mL，3 000     范 围 内 ，适 合 肺 部 吸 入 微 粒 的 要 求      [9―10] ；载 药 量 为
          r/min 离心 10 min，取沉淀细胞加 200 μL 磷酸盐缓冲液              （4.43±0.08）%。
          重悬，混匀，采用全自动血细胞分析仪进行细胞分类计                           3.2 Cur-SLN-FL的肺部刺激性结果
          数，分别计数白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒                              如图1所示，空气对照组大鼠气管有轻度组织水肿、
          细胞，得到各类细胞的比例，根据总细胞数量计算出各                           中度嗜酸性粒细胞浸润，肺泡壁未见明显增厚，有轻微
          类细胞的绝对数量。                                          炎症细胞浸润。与空气对照组比较，空白 SLN-FL 组大
          2.3.4 气管及肺组织形态变化的观察                                鼠气管出现组织水肿，少量嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸
              取各组小鼠气管及部分右肺组织，于 4% 多聚甲醛                       润，肺泡壁增厚、间隔增宽，炎症细胞浸润（以淋巴细胞
          固定，常规脱水，石蜡包埋，二甲苯脱去切片中的石蜡，                          为主），偶见肺泡断裂；Cur-SLN-FL 组大鼠气管和肺部
          再经常规乙醇梯度洗脱、石蜡包埋后，切片（4 μm 厚                         未见明显炎症反应。与空白 SLN-FL 组比较，Cur-SLN-
          度），进行HE染色以评估各组小鼠气管及肺组织的形态                          FL组大鼠气管嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润均减轻，肺


          中国药房  2023年第34卷第14期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 14    · 1693 ·
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