Page 77 - 《中国药房》2023年13期

动行为。评分结果为 1～3 分表示大鼠 MCAO 造模成 1∶200），室温孵育 50 min；DAB 显色，阳性表达为棕黄
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功 。剔除造模过程中死亡大鼠和评分不达标大鼠，剩 色；自来水冲洗切片终止显色，复染细胞核，脱水封片。
余大鼠继续给药 3 d。最终假手术组剩余大鼠 11 只，模 采用 Image J 软件进行平均光密度分析，通过平均光密
型对照组11只，尼莫地平片组10只，中风瘀热方高剂量 度值来反映免疫组化的蛋白表达强度。
组9只，中风瘀热方低剂量组9只。 2.7 统计学方法
2.2 标本采集与处理 使用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。计量
末次给药前12 h大鼠禁食不禁水。末次给药后1 h 资料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进
进行麻醉，方法同“2.1”项下。腹主动脉取血 3～5 mL， 一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
血液静置 4 h 后以 4 000 r/min 离心 10 min，取上清液。 3 结果
大鼠处死后，快速取出其大脑、脾脏，用含肝素的等渗盐 3.1 大鼠一般情况、神经功能评分和脏器指数测定结果
水冲洗，并用滤纸吸干、称质量。将部分脑组织用于制 造模前 7 d，各组大鼠精神状态良好，进食、进水正
备 TTC 染色和 HE 染色病理切片，其他脑组织及血清样 常，体质量整体呈缓慢增长趋势。在造模后3 d，模型对
本于－80 ℃冰箱中保存备用。 照组大鼠精神状态出现萎靡不振，进食、进水少量，体质
2.3 大鼠一般情况观察、神经功能评分和脏器指数计算 量呈逐渐下降趋势。与模型对照组比较，各给药组大鼠
实验期间每天观察大鼠的一般情况，包括毛色、饮 精神状态有所改善，进食、进水有所恢复，体质量呈逐渐
水量、进食量、动作行为等，并记录其体质量。对造模成 下降趋势但均高于模型对照组。各组大鼠的体质量变
功的大鼠，于术后自然苏醒后、造模后1 d、造模后3 d分 化见图 1A。对造模成功后的大鼠继续灌胃给药 3 d，结
别进行神经功能评分（每组 9～11 只），评分方法和标准 果显示，造模后 1 d，与假手术组比较，模型对照组大鼠
同“2.1”项下。计算大鼠脏器（脑、脾）指数：脏器指数＝ 神经功能评分显著升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，
脏器质量（g）/大鼠体质量（kg）。 各给药组大鼠神经功能评分差异无统计学意义（P＞
2.4 大鼠脑梗死面积及脑组织病理形态学观察 0.05）。造模后3 d，与假手术组比较，模型对照组大鼠神
采用 TTC 染色及 HE 染色法观察。取大鼠（每组 经功能评分显著升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，尼
5～6只）脑组织，置于冰箱中冷冻15 min，待大脑稍冻硬 莫地平片组大鼠神经功能评分显著降低（P＜0.01），中
后取出，用锋利刀片沿大脑冠状面切片（约 2 mm/片）。 风瘀热方高、低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），详
立即放入 2%TTC 染液中，37 ℃下避光孵育，每隔 5 min 见图1B。脏器指数测定结果显示：与假手术组比较，模
摇晃1次脑组织切片，使其均匀接触到染液；20 min后取 型对照组大鼠脑指数、脾指数均显著升高（P＜0.01）；与
出脑组织切片，放入10%福尔马林溶液中固定。TTC染 模型对照组比较，各给药组大鼠脑指数、脾指数均有不
色正常组织呈深红色，梗死区域呈白色。使用 Image J 同程度的回调，其中尼莫地平片组、中风瘀热方高剂量
软件对照片进行分析，计算脑梗死面积占比：脑梗死面 组大鼠脑指数、脾指数显著降低（P＜0.01）。大鼠脑指
积占比（%）＝脑梗死区域面积/整个脑组织面积× 数、脾指数测定结果见图1C、图1D。
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100% 。将取出的新鲜大鼠脑组织放入预先配制好的 380 4
Ⅰ Ⅰ
10% 福尔马林溶液中固定 24 h，常规制备石蜡切片（厚 360 Ⅱ 3 a Ⅱ
Ⅲ
Ⅲ
度为4～6 µm）并进行HE染色，在显微镜下观察脑组织 体质量/g 340 Ⅳ 神经功能评分/分 2 a b Ⅳ
320
Ⅴ
Ⅴ
病理形态学变化。 300 1
280 0
2.5 大鼠脑组织及血清中炎症指标检测 0 5 10 0 1 2 3
采用酶联免疫吸附法检测。取“2.2”项下冻存的脑 时间/d 时间/d
A.体质量变化图 B.神经功能评分变化图
组织和血清样本（每组4～5只大鼠），常规解冻后，按相
10 2.0 a
应试剂盒方法操作检测大鼠脑组织和血清中TNF-α、IL- 8 a 1.5 b b
6水平。 （ g/kg ） 6 b b （ g/kg ） 1.0
2.6 大鼠脑组织中caspase-3、p-AKT蛋白表达的检测 脑指数/ 4 脾指数/ 0.5
采用免疫组化法检测。取“2.2”项下冻存的大鼠脑 2
0 0
组织（每组 4～5 只大鼠），室温解冻 20 min，制备脑组织 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
石蜡切片（厚度为 4～6 µm），将切片脱蜡至水进行抗原 C.脑指数柱状图 D.脾指数柱状图
Ⅰ：假手术组；Ⅱ：模型对照组；Ⅲ：尼莫地平片组；Ⅳ：中风瘀热方
修复，然后放入3%双氧水溶液中，室温避光孵育25 min；
高剂量组；Ⅴ：中风瘀热方低剂量组；a：与假手术组比较，P＜0.01；b：
以3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min，滴加caspase-3 与模型对照组比较，P＜0.01。
和 p-AKT 一抗（稀释度分别为 1∶100、1∶200），4 ℃孵育 图1 各组大鼠体质量、神经功能评分和脏器指数测定
过夜；洗膜后滴加 HRP 标记的山羊抗兔二抗（稀释度为 结果（n＝9～11）

中国药房 2023年第34卷第13期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 13 · 1603 ·