Page 56 - 《中国药房》2023年13期
P. 56

各给药组大鼠灌胃相应药物，对照组和模型组大鼠灌胃                            2.8 大鼠肾皮质中 PA、PAI-1、Wnt4、β-catenin 蛋白表
          等体积纯化水；每天给药 1 次，连续 16 周。实验干预 16                     达水平检测
          周内，模型组大鼠死亡 4 只，厄贝沙坦组大鼠死亡 3 只，                           采用Western blot法进行检测。取“2.3”项下冻存的
          通心络胶囊组死亡 2 只（另外有 1 只大鼠在干预过程中                        肾皮质适量，提取总蛋白，采用 BCA 法测定蛋白浓度
          血糖恢复，故也予以剔除）。                                       后，于 100 ℃下变性 5 min。取变性后的蛋白 50 μg，于
          2.2 大鼠空腹血糖、24 h尿蛋白检测                                4 ℃、120 V 条件下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝
              各组大鼠末次给药后禁食 12 h，尾静脉采血，检测                       胶电泳，转膜；以5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，加入一抗
          大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）。收集各组             （PA、PAI-1、Wnt4稀释度均为1∶500，β-actin、β-catenin稀
          大鼠 24 h 尿液，离心后取上清液，采用终点法检测 24 h                     释度均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；洗膜后避光加入荧光
          尿蛋白（24 h urinary total protein，24 h UTP）。           二抗（稀释比例为1∶10 000），37 ℃避光孵育1 h；洗膜后
          2.3 样本收集                                            采用红外激光扫描仪分析条带灰度值，以目的蛋白条带
              尿液收集后，麻醉大鼠并剖开腹腔，然后进行腹主                          灰度值与内参 β-actin 条带灰度值的比值表示目的蛋白
                                                              的表达水平。
          动脉采血，离心分离血清，4 ℃保存备用。采血完成后，
                                                              2.9 统计学方法
          快速分离大鼠肾脏，切割肾皮质，将肾皮质分别置于4%
                                                                  采用 SPSS 21.0 软件进行数据处理。实验数据以
          中性甲醛溶液及冻存管中，保存备用。
                                                              x±s 表示，若方差齐，采用单因素方差分析和 SNK-q 检
          2.4 大鼠肾皮质病理形态学观察
                                                              验进行统计分析；若方差不齐，采用秩和检验。检验水
              取“2.3”项下固定于 4% 中性甲醛溶液的肾皮质适
                                                              准α＝0.05。
          量，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度
                                                              3 结果
          2 μm）、二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化后，进行 Masson 染
                                                              3.1 通心络胶囊对 DN 模型大鼠 FBG、24 h UTP 的
          色、封片，采用显微镜观察切片并采集图像。
                                                              影响
          2.5 大鼠血清中PA、PAI-1水平检测
                                                                  与对照组比较，模型组大鼠 FBG、24 h UTP 均显著
              采用 ELISA 法进行检测。取“2.3”项下保存的大鼠
                                                              升高（P＜0.05）；与模型组比较，厄贝沙坦组和通心络胶
          血清样品，按照 ELISA 试剂盒说明书方法处理，然后采
                                                              囊组大鼠 24 h UTP 均显著降低（P＜0.05）；与厄贝沙坦
          用酶标仪于 450 nm 波长处检测大鼠血清中 PA、PAI-1
                                                              组比较，通心络胶囊组大鼠 FBG、24 h UTP 差异均无统
          水平。
                                                              计学意义（P＞0.05）。结果见表2。
          2.6 大鼠肾皮质中 TGF-β1、COL-Ⅳ、Wnt4、β-catenin
                                                               表2 各组大鼠FGB、24 h UTP检测结果（x±s，n＝8）
          mRNA表达水平检测
                                                              组别                    FGB/（mmol/L）   24 h UTP/mg
              采用实时荧光定量PCR法进行检测。取“2.3”项下                       对照组                    5.66±0.86      6.33±1.58
          冻存的大鼠肾皮质适量，提取总 RNA，并将其反转录成                          模型组                    28.75±4.76 a  33.64±5.25 a
                                                              厄贝沙坦组                  28.27±5.64    26.03±4.98 b
          cDNA进行PCR扩增。PCR反应条件为95 ℃预变性30
                                                              通心络胶囊组                 27.31±4.99    24.57±6.17 b
          s；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环。以
                                                                 a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05。
          β-actin 为内参，采用 2   －ΔΔCt 法计算目的基因 mRNA 的表
                                                              3.2 通心络胶囊对 DN 模型大鼠肾皮质病理形态学的
          达水平。
                                                              影响
          2.7 大鼠肾皮质中 TGF-β1、COL-Ⅳ、FAK、ILK、E-                      对照组大鼠肾皮质可见肾小球、肾小管无明显异
          cadherin蛋白表达水平检测                                    常；模型组大鼠肾皮质中肾小球肥大，基底膜轻度增厚，
              采用免疫组化法进行检测。取“2.3”项下冻存的肾                        系膜细胞和基质增多，肾小囊腔变窄；与模型组比较，厄
          皮质适量，经梯度脱水后，以石蜡包埋切片。将切片脱                            贝沙坦组和通心络胶囊组大鼠肾皮质病理损伤及纤维
          蜡、微波修复后，置于 3% 过氧化氢溶液中，以磷酸盐缓                         化减轻。结果见图1。
          冲液（PBS）冲洗，滴加 10% 山羊血清封闭液，室温孵育                       3.3 通心络胶囊对 DN 模型大鼠血清和肾皮质中 PA、
          30 min；滴加一抗（TGF-β1稀释度为1∶200、COL-Ⅳ稀释                 PAI-1水平的影响
          度为 1∶200、FAK 稀释度为 1∶100、ILK 稀释度为 1∶50、                  与对照组比较，模型组大鼠血清和肾皮质中PA（蛋
          E-cadherin 稀释度为 1∶100），4 ℃孵育过夜；滴加二抗                 白表达）水平均显著降低、PAI-1（蛋白表达）水平均显著
         （稀释度为1∶200），37 ℃孵育30 min；滴加C液，37 ℃孵                  升高（P＜0.05）；与模型组比较，厄贝沙坦组和通心络胶
          育 30 min；以 DAB 显色，苏木素复染 3 min，经乙醇梯度                 囊组大鼠血清和肾皮质中上述指标水平均显著逆转
          脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后，采用显微镜观察，                          （P＜0.05），且2个给药组间上述指标水平差异无统计学
          并以棕黄色为阳性表达。                                         意义（P＜0.05）。结果见图2、表3。


          · 1586 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 13                            中国药房  2023年第34卷第13期
   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61