Page 55 - 《中国药房》2023年13期

成、肾小管间质纤维化，最终出现球性硬化和荒废 [1―2] 。 （批号分别为1068283、1067862）均购自上海蓝基生物科
肾小球细胞外基质（extracellular matrix，ECM）积聚是导 技有限公司；兔源β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（批号
致肾小球硬化的病理基础，纤溶酶原激活物（tissue-type 3309872）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔源
plasminogen activator，PA）、纤溶酶原激活剂抑制因子 1 PA 多克隆抗体（批号 a11876）购自美国 ABclonal 公司；
（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）作为纤溶系统 兔源PAI-1、COL-Ⅳ、黏着斑激酶 （focal adhesion kinase，
的关键因子在 ECM 的降解中起重要作用，其异常表达 FAK）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗体（批号分别为
会进一步导致 ECM 积聚、肾小球硬化及肾小管间质纤 15060320、15060109、15061189、15060220）均购自沈阳
维化 。转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1， 万类生物科技有限公司；兔源TGF-β1多克隆抗体（批号
[3]
TGF-β1 ）是重要的致纤维化因子，其高表达能增加系膜 56985 ）购自美国Bioworld Technology公司；兔源整合素
细胞 ECM 的产生，刺激 ECM 主要成分Ⅳ型胶原蛋白 连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）多克隆抗体、兔源
（type Ⅳ collagen，COL-Ⅳ）的增加，从而促进肾间质纤 β-catenin单克隆抗体（批号分别为130981、211375）均购
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维化 。纤溶系统失衡及 TGF-β1的高表达可致内环境 自 英 国 Abcam 公 司 ；兔 源 Wnt4 多 克 隆 抗 体（批 号
紊乱，从而激活肾脏中 Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号 1872987）购自美国 GeneTex 公司；辣根过氧化物酶标记
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通路，进而推动纤维化的进程，加重肾功能恶化进展 。 的山羊抗兔免疫球蛋白 G 二抗（批号 GB23303）购自武
因此，抑制Wnt/β-catenin信号通路激活对于减轻肾纤维 汉赛维尔生物科技有限公司。本研究所用 PCR 引物由
化程度具有重要作用。 生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，PCR引
清朝医家叶天士云：“初病在经，久病血伤入络”，在 物序列及扩增产物长度见表1。
消渴病（即糖尿病）气阴两虚病机基础上，加之 DN 病程 表1 PCR引物序列及扩增产物长度
日久缠绵，患者久病多瘀、久瘀入络、久病入络。现代吴 基因 引物序列（5′→3′） 扩增产物长度/bp
以岭院士创立络病学学科，依据络病学理论，肾脏的毛 β-actin 上游：ACCCGCGAGTACAACCTTCT 266
下游：TTCAGGGTCAGGATGCCTCT
细血管网符合脉络的概念，因此“肾络瘀阻”为 DN 致病
COL-Ⅳ 上游：GGCCCCTGCTGAAGCGTT 139
的核心病机且贯穿DN病程始终。通心络胶囊在络病学 下游：GTTCCCCGAGCACCTTAG
理论的基础上拟定而成，由人参、水蛭、全蝎、赤芍、蝉 TGF-β 1 上游：ATGGTGGACCGCAACAAC 329
下游：TGAGCACTGAAGCGAAAGC
蜕、土鳖虫、蜈蚣、檀香、降香、乳香（制）、酸枣仁（炒）、冰
Wnt4 上游：AGCCCACAGGGTTTCCA 233
片12味药材组成，具有益气活血、通络止痛的功效；多项 下游：GCTCGCCAGCATGTCTTT
临床研究也表明，其对DN具有延缓病情进展、保护肾功 β-catenin 上游：AACGGCTTTCGGTTGAGCTG 147
能的作用 [6―7] ，但具体作用机制并不明确。基于此，本研 下游：TGGCGATATCCAAGGGCTTC
究以 DN 模型大鼠为研究对象，基于肾纤维化经典信号 1.3 动物
通路 Wnt/β-catenin，探讨通心络胶囊对 DN 的干预作用 本研究所用动物为清洁级雄性SD大鼠，共45只，体
及可能机制，以期为DN的临床治疗提供实验依据。 质量为（120±20） g，购自河北医科大学实验动物中心，
1 材料 动物生产许可证号为SCXK（冀）2018-1-004。本实验由
1.1 主要仪器 河北医科大学实验动物伦理委员会批准，批准号为
本研究所用主要仪器有 NanoDrop2000C 型紫外分 DW2019001。
光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司），Eco型实 2 方法
时定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国 Illumina 公司）， 2.1 造模、分组和给药
BX63+DP72 型正置显微镜（日本 Olympus 公司），Odys‐ 大鼠适应性饲养1周后，随机选取8只作为对照组，
sey型红外激光扫描仪（美国LI-COR公司）。 给予普通饲料饲养，剩余37只作为造模组，给予高糖高
1.2 主要药品与试剂 脂饲料（由河北医科大学实验动物中心加工制作，含绵
通心络胶囊购自石家庄以岭药业股份有限公司（规 白糖 10%、蛋黄粉 10%、食用猪油 10%、胆固醇 1.5%、胆
格 0.26 g/粒，批号 A2110023，国药准字 Z19980015）；厄 酸盐 0.5%，其余为普通全价颗粒饲料）饲养。大鼠饲
贝沙坦片购自赛诺菲（杭州）制药有限公司（规格 0.15 养 6 周 后 ，造 模 组 大 鼠 禁 食 不 禁 水 12 h，腹 腔 注 射
g/片，批号CHG0360，国药准字J20130049）；链脲佐菌素 1%STZ 溶液（35 mg/kg），72 h 后尾静脉取血检测血糖，
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（streptozotocin，STZ）（批号 04081408）购自美国 Enzo 公 当血糖≥16.7 mmol/L 时，表明 DN 模型复制成功 。造
司；DNA 第一链合成试剂盒（批号 KR202）购自北京天 模组有3只大鼠血糖检测不达标，故予以剔除。将造模
根 生 化 科 技 有 限 公 司 ；Platinum SYBR Green qPCR 成功的大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组（阳性对照，
SuperMix-UDG（批号 11733046）购自美国 Invitrogen 公 14.12 mg/kg，临床等效剂量）、通心络胶囊组（0.3 g/kg，
司；大鼠 PA、PAI-1 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒 临床等效剂量）。其中模型组 12 只，其余 2 组各 11 只。

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