Page 49 - 《中国药房》2023年13期
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4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15 min，取上清液经0.22 μm          2.3.4 分子对接
          微孔滤膜过滤，备用。                                           通过TCMSP数据库下载中心度值、亲中心度值、综
          2.2.2 色谱条件                                         合排名前 12 位化学成分的 MOL2 格式结构文件，经
            采用 Waters UPLC BEH C18 （100 mm×2.1 mm，1.7        AutoDock Tool 1.5.6 软件加氢、定义原子类型处理后将
          μm）色谱柱，以 0.1% 甲酸溶液（A）-乙腈（含 1% 甲酸，                  文件保存为 pdbqt 格式，作为小分子化合物配体；通过

          B）为 流 动 相 进 行 梯 度 洗 脱（0～11.0  min，85%A→            PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）选择下载靶点蛋白
          25%A；11.0～12.0  min，25%A→2%A；12.0～14.0  min，       的 3D 结构（PDB 格式），去水、加氢处理后保存为 pdbqt
          2%A；14.0～14.1  min，2%A→85%A；14.1～16.0  min，        格式，作为受体；通过AutoDock Tool 1.5.6软件对配体和受
          85%A）；流速为 0.3 mL/min；进样量为 5 μL。                    体进行分子对接并计算结合能。若结合能＜0 kcal/mol，表
          2.2.3 质谱条件                                         明配体分子能和受体蛋白自发结合；若结合能＜－5
            以 Xcalibur 控制软件为检测器在正、负离子模式下                     kcal/mol，表明配体分子与受体蛋白结合良好。结合能
          扫描；锥孔气流速为35 arb，辅助气流速为15 arb；离子转                   越小表明化合物和受体之间的相互作用越稳定 。采用
                                                                                                      [9]
          移管温度为350 ℃；汽化器温度为350 ℃；全质谱分辨率
                                                             Pymol软件对图像进行可视化分析。
          为 60 000，二级质谱分辨率为 15 000；质量扫描范围为
                                                             2.4 体内验证实验
          50～2 000 Da；碰撞能量为 16/32/48 eV，正、负离子喷雾
                                                             2.4.1 分组、建模与给药
          电压分别为 5.5、－4.0 kV；采用 L-2-氯苯丙氨酸（10
                                                               将实验小鼠按体质量随机分为 7 组，分别为正常对
          μg/mL）进行实时校正。
                                                             照组、模型组、美沙拉嗪组（阳性对照1，0.30 g/kg）、肠炎
          2.3 WZDK治疗肠炎的作用靶点预测
                                                             宁组（阳性对照 2，1.38 g/kg）和 WZDK 低、中、高剂量组
          2.3.1 WZDK、肠炎靶点的获取
                                                            （1.25、2.50、5.00 g/kg），每组 10 只。各给药组小鼠的给
             根 据 LC-MS/MS 分 析 结 果 以 及 TCMSP 数 据 库
                                                             药剂量均参考本课题组前期预实验结果设置。除正常
         （https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）中以生物利用度（oral
                                                             对照组外，其余各组小鼠自由饮用4%DSS溶液7 d（每2
          bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥
                                                             d 更换 1 次新配制的 DSS 溶液）以诱导建立小鼠急性肠
          0.18为筛选标准，获取WZDK的化学成分；通过TCMSP
                                                             炎模型，若小鼠出现体质量下降、稀便、便血现象则表示
          数据库、PhamMapper 数据库（http：//www.lilab-ecust.cn/
                                                                                      [10]
                                                             小鼠急性肠炎模型构建成功 。在建立模型的同时，各
          pharmmapper/）收集各成分对应靶点；通过 GeneCards
                                                             给药组小鼠按照10 mL/kg给药体积灌胃相应药液（溶剂
          数 据库（https：//www.Genecards.org/）、OMIM 数据库
                                                             为0.5%羧甲基纤维素钠溶液），正常对照组和模型组小
         （https：//www.omim.org/），以“enteritis”为关键词获取肠
                                                             鼠灌胃等体积 0.5% 羧甲基纤维素钠溶液；每天灌胃 1
          炎的相关靶点，并去除重复靶点。
                                                             次，连续10 d。
          2.3.2 蛋白质互作网络及核心靶点的构建
                                                             2.4.2 小鼠一般状况观察及疾病活动指数评分计算
            利用微生信在线生物信息分析数据库（https：//
                                                               每日于同一时间观察并记录小鼠体质量变化、精神
          www.bioinformatics.com.cn/）获得交集靶点，将交集靶点
                                                             状态、毛发色泽、粪便性状等一般状况。采用隐血测定
          导入到 String 数据库（https：//cn.string-db.org/）中构建蛋
                                                             试剂盒检测粪便隐血情况，并根据疾病活动指数（disease
          白 质 互 作 网 络（protein-protein  interaction  networks，
          PPI），限定物种为“Homo Sapiens”，设置最低置信度为                  activity index，DAI）标准，计算各组小鼠的 DAI 评分，
          0.9，下载对应的 TSV 格式文件并将其导入到 Cytoscape                 DAI评分＝（小鼠体质量下降百分比+粪便黏稠度+粪便
                                                                        [11]
          3.7.2 软件中，以节点度值中位数的 2 倍为阈值，同时以                     隐血分数）/3 。
                                                  [8]
          度值、紧密度、介数中心度为阈值筛选核心靶点 。                            2.4.3 标本采集
          2.3.3 富集分析                                           末次给药后，所有小鼠禁食不禁水 12 h，处死后分
            利用 DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行       离结肠组织。将距肛门4 cm处的结肠组织（1～2 cm）放
          基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因                  入 4% 多聚甲醛溶液中固定；剩余结肠组织分装于冻存
          与 基 因 组 百 科 全 书（Kyoto  encyclopedia  of  genes  and   管内，－80 ℃保存备用。
          genomes，KEGG）信号通路富集分析，选取条件为 P＜                     2.4.4 小鼠结肠组织病理学观察
          0.01，GO功能富集分析结果取前10位，KEGG信号通路                        采用苏木素-伊红（HE）染色法进行观察。小鼠结肠
          分析结果取前30位，采用微生信在线生物信息分析数据                          组织经 4 %多聚甲醛固定后，放入包埋盒，乙醇梯度脱
          库实现富集分析结果的可视化。                                     水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成厚度为 4 μm 的结肠组


          中国药房  2023年第34卷第13期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 13    · 1579 ·
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