Page 60 - 中国药房2023年10期
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腹腔注射致敏，隔天1次，共7次。第14天，每只大鼠以                          即为病理评分 。
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          2%OVA溶液（每侧50 μL）滴鼻，每天1次，共7天。在末                      2.4 大鼠鼻黏膜组织中ROS水平的检测
          次滴鼻结束 30 min 后，观察各组大鼠 5 min 内的行为并                       采用流式细胞仪进行检测。取“2.3”项下各组 5 只
                                                                                                  2
          进行行为学评分——喷嚏：1～3 个记 1 分，4～10 个记 2                    大鼠的鼻黏膜组织适量，切成面积约1 mm 的小片，用磷
          分，≥11个记3分；鼻痒：轻度瘙痒、抓挠1～2次记1分，                        酸盐缓冲液清洗后，加入胶原酶 1 mL，于 37 ℃下孵育
          剧烈瘙痒、抓挠＞2次记2分；鼻流涕：鼻涕流至鼻孔记1                          10 min（每5 min振摇1次）；待组织解离完全后，用3%胎
          分，鼻涕超出鼻孔记 2 分，鼻涕流满面记 3 分；叠加各项                       牛血清终止消化，并以 70 μm 滤网滤过；细胞加入磷酸
                                                     [14]
          评分得行为学评分，该评分超过5分即为造模成功 。                            盐缓冲液 10 mL，离心，吸去上清液；细胞加入 2′，7′-二
              造模成功后，按照随机数字表法将大鼠分为模型                           氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）工作液（用无血清RPMI-
          组、YPF+组、MF组，另设空白组，每组10只。YPF+组大                      1640培养液制备，终浓度为10 μmol/L）500 μL，于37 ℃
          鼠给予 YPF+滴鼻，每侧 50 μg（剂量参考前期研究结果                      下孵育20 min，以无血清RPMI-1640培养液清洗3次，再
          设置  [11―12] ），每天 2 次；MF 组大鼠给予 MF 鼻喷雾剂滴              以磷酸盐缓冲液重悬，使用流式细胞仪检测其荧光强
          鼻，每侧50 μg（剂量参考其药品说明书设置），每天1次；                       度，用以表示ROS水平（两者成正比）。
          空白组和模型组大鼠给予等量生理盐水滴鼻，每天2次，                           2.5 大鼠鼻黏膜组织中 NLRP3、caspase-1、GSDMD 蛋
          连续4周。                                               白表达的检测
              末次给药并完成行为学评分后，采集各组大鼠腹主                          2.5.1 免疫组化实验 取“2.3”项下各组大鼠的鼻黏膜
          动脉血用于ELISA检测；取血后，处死大鼠，每组随机选                         组织石蜡切片，脱蜡至水，进行抗原修复以阻断内源性
          取其中5只大鼠的鼻黏膜组织用于病理切片、流式细胞                            过 氧 化 氢 酶 ，滴 加 3% 山 羊 血 清 封 闭 30  min，滴 加
          仪检测和免疫组化实验，剩余5只大鼠的鼻黏膜组织用                            NLRP3、caspase-1、GSDMD 一抗（稀释比例均为 1∶50），
          于 Western blot 实验和反转录聚合酶链反应（reverse                 于4 ℃下孵育过夜；滴加相应二抗（稀释比例为1∶200），

          transcription PCR，RT-PCR）实验。                        于 37 ℃下孵育 30 min；用磷酸盐缓冲液洗涤 5 min×3
          2.2 大鼠行为学评分                                         次，加入DAB显色；用水冲洗，以苏木精染液轻度复染，

              末次给药结束 30 min 后，观察各组大鼠 5 min 内的                 脱水，以中性树胶封片，置于显微镜下观察。以棕黄色
                                              [14]
          行为，并按“2.1”项下标准进行行为学评分 。                             为阳性染色，采用 Image-Pro Plus 软件检测阳性区域的
          2.3 大鼠鼻黏膜病理切片观察                                     平均光密度（average optical，AO）值，用以表示 NLRP3、
              取“2.1”项下各组 5 只大鼠的鼻中隔及鼻腔外侧壁                      caspase-1、GSDMD蛋白的表达水平（两者成正比）。
          黏膜组织适量，置于 4% 多聚甲醛溶液中固定 48 h，脱                       2.5.2 Western blot 实验 取“2.3”项下各组剩余 5 只大
          水，石蜡包埋后切片（厚度 3 μm），经苏木精-伊红（HE）                      鼠的鼻黏膜组织，提取总蛋白后使用 BCA 法测定蛋白
                                           [15]
          染色（苏木精染液按照Harris方法配制 ；伊红染液以水                        浓度；蛋白变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝
          为溶剂，浓度为 0.25%），并使用显微镜观察其鼻黏膜组                        胶电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯膜上，用 5% 脱脂奶
          织的病理改变；同时，任选10个200倍视野，观察各组大                         粉封闭1 h；加入NLRP3、GSDMD、caspase-1、GAPDH一
          鼠鼻黏膜上皮层、基底膜、固有层和黏膜下层的状况并                            抗（稀释比例分别为1∶1 500、1∶1 000、1∶500、1∶1 000），
          进行量化评分——（1）炎症细胞浸润程度：未见炎症细                           于4 ℃下孵育过夜；用磷酸盐缓冲液清洗10 min×3次，
          胞记0分，可见少数散落炎症细胞记1分，可见较多炎症                           加入相应二抗（稀释比例为1∶10 000），避光孵育45 min；
          细胞记 2 分，炎症细胞占全部上皮面积的 2/3 以上记 3                      用磷酸盐缓冲液清洗 10 min×3 次，以 ECL 发光试剂显
          分；（2）上皮的化生程度：未见上皮化生记0分，上皮化生                         色，于显影仪下成像并使用 Image J 软件分析各条带灰
          占全部上皮面积的1/3以下记1分，上皮化生占全部上皮                          度值，以 GAPDH 作为内参，计算各目标蛋白的表达
          面积的1/3～2/3记2分，上皮化生占全部上皮面积的2/3                       水平。
          以上记3分；（3）黏膜固有层腺体增生：未见腺体记0分，                         2.6 大鼠鼻黏膜组织中 NLRP3、caspase-1、GSDMD
          腺体占黏膜固有层面积的1/3以下记1分，腺体占黏膜固                          mRNA表达的检测
          有层面积的 1/3～2/3 记 2 分，腺体占黏膜固有层面积的                         采用RT-PCR进行检测。取“2.3”项下各组剩余5只
          2/3 以上记 3 分；（4）血管扩张充血：血管未见异常记 0                     大鼠的鼻黏膜组织100 mg，研磨匀浆，按照RNA抽提试
          分，血管轻度扩张、充血记1分，血管明显扩张、充血记2                          剂盒说明书方法提取RNA，按照cDNA第一链合成试剂
          分，血管明显扩张、充血并有增生记3分；叠加各项评分                           盒说明书方法反转录得cDNA。以上述cDNA为模板进


          · 1206 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 10                            中国药房  2023年第34卷第10期
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