Page 43 - 中国药房2023年10期
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入山羊抗兔IgG二抗（稀释比例为1∶10 000），37 ℃避光                   白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值表示目的蛋白的表
          孵育 2 h；使用 DAPI 染色，室温避光孵育 5 min，封片并                 达水平（cleaved caspase-3 蛋白的表达还需以 caspase-3
          加入荧光淬灭封片液后，置于光学显微镜下观察并拍                            蛋白为对照）。实验重复3次。
          照。以绿色荧光的强度来表示目的蛋白的表达水平。                            2.6 验证实验
          2.4 柚皮素对LX2细胞肝纤维化标志物mRNA表达影                            使用凋亡通路抑制剂进一步验证柚皮素的促凋亡
          响的检测                                               作用机制。
              采用 q-PCR 法进行检测。取对数生长期的 LX2 细                   2.6.1 MTT 实验 取对数生长期的 LX2 细胞，按每孔
          胞，按“2.3.1”项下方法分组、给药。培养24 h后，提取细                    1×10 个（每孔 100 μL）接种于 96 孔板中，于 37 ℃、
                                                                  4
          胞总 RNA。待测定浓度后，将总 RNA 逆转录成 cDNA，                    5%CO2 条件下培养 24 h。将细胞分为柚皮素组（40
          随后进行PCR扩增。PCR反应体系（总体积15 μL）为：                      μmol/L）、柚 皮 素 +FMK 组（二 者 浓 度 分 别 为 40、10
          cDNA模板1 μL、SYBR Premix Ex Taq（Ti RNaseH plus）      μmol/L）、柚皮素+F1组（二者浓度分别为40、1 μmol/L）、
          7.5 μL、上/下游引物各0.6 μL、ddH2O 5.3 μL。PCR反应            柚皮素+NEC-1 组（二者浓度分别为 40、10 μmol/L），每
          条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火10 s，              组设置6个复孔，同时设置不含细胞、不含药物的调零组
          72 ℃延伸30 s，共循环40次。反应结束后，以磷酸甘油                      和不含药物的空白对照组。按“2.2”项下方法处理并计
          醛脱氢酶（GAPDH）为内参，采用 2           －ΔΔCt 法计算 collagen   算增殖抑制率。柚皮素的干预浓度参考“2.2”项下实验
          Ⅰ前体 α1-pro collagen Ⅰ、α-SMA mRNA 的表达水平。            结果，FMK、F1、NEC-1的干预浓度参考相关文献 。
                                                                                                      [10]
          各引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合                           2.6.2 台盼蓝染色实验 将经 75% 乙醇浸泡（30 min）
          成，其具体序列和产物长度见表1。                                   过的玻片置于24孔板中，加入含2×10 个LX2细胞的悬
                                                                                              5
                      表1 引物序列和产物长度                           液2 mL。待细胞贴壁后，将其分为空白对照组、柚皮素
          目的基因         引物序列                      产物长度/bp     组（40 μmol/L）、柚皮素+FMK 组（二者浓度分别为 40、
          α1-pro collagen Ⅰ  上游：5′-ATTCCAGTTCGAGTATGGCGG-3′  234
                       下游：5′-GTTGCTTGTCTGTTTCCGGGT-3′        10 μmol/L，抑制剂的选择参考“2.6.1”项下实验结果），
          α-SMA        上游：5′-GCGTGGCTATTCCTTCGTTAC-3′  148   每组设置 3 个复孔。培养 24 h 后，按“2.5.1”项下方法染
                       下游：5′-CATAGTGGTGCCCCCTGATAG-3′        色、观察各组细胞的凋亡情况并计算凋亡细胞比例。
          GAPDH        上游：5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′  83
                       下游：5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′         2.6.3 JC-1 实验 将经 75% 乙醇浸泡（30 min）过的玻
                                                                                         5
          2.5 柚皮素对LX2细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达影响                         片置于 24 孔板中，加入含 2×10 个 LX2 细胞的悬液 2
          的检测                                                mL。待细胞贴壁后，按“2.6.2”项下方法分组、给药。培
          2.5.1 台盼蓝染色实验 将经 75% 乙醇浸泡（30 min）                  养 24 h 后，加入 JC-1 染色工作液 1 mL，混匀，37 ℃孵育
          过的玻片置于24孔板中，加入含2×10 个LX2细胞的悬                       20 min；吸弃上清液，细胞以 JC-1 染色缓冲液清洗 2 次，
                                          5
          液2 mL。待细胞贴壁后，用不同浓度（10、20、40 μmol/L）                置于光学显微镜下观察细胞染色情况（红色荧光表示细
          的柚皮素干预，每浓度设置3个复孔，同时设置不含药物                          胞线粒体膜电位完整，细胞活性较高；绿色荧光表示线
          的空白对照组。培养24 h后，以磷酸盐缓冲液清洗2次；                        粒体膜电位消失，细胞发生凋亡；叠加黄色区域越小，表
          加入台盼蓝染液，孵育 3 min；以磷酸盐缓冲液清洗，置                       明细胞凋亡越多）。
          于光学显微镜下观察、拍照（凋亡细胞被染成蓝色）并计                          2.7 统计学方法
          算凋亡细胞比例。                                               采用 SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析，采用
          2.5.2 Western blot实验 取对数生长期的LX2细胞，按                GraphPad Prism 7 软件作图。实验数据以 x±s 表示，多
         “2.3.1”项下方法分组、给药。培养 24 h 后，收集各组细                    组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用
          胞并提取蛋白，电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯膜上，                           SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          用5%脱脂奶粉室温封闭2 h；以TBST缓冲液洗膜，加入                       3 结果
          β-actin、Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3 一抗（稀  3.1 柚皮素对LO2和LX2细胞增殖抑制率的影响
          释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；以TBST缓冲液洗                        不同浓度的柚皮素对正常肝细胞 LO2 的增殖抑制
          膜，加入山羊抗兔IgG二抗（稀释比例为1∶10 000），室温                    率无明显影响，而 10、20、40 μmol/L 的柚皮素能显著升
          孵育 2 h；以 TBST 缓冲液洗膜，用 ECL 化学发光底物显                  高 LX2 细胞的增殖抑制率（P＜0.05）。因此，后续实验
          影液进行显色，置于全自动化学发光成像分析系统下曝                           以 10、20、40 μmol/L 作为柚皮素的干预浓度。结果
          光成像并使用 Image J 1.53e 软件进行分析。以目的蛋                   见图1。


          中国药房  2023年第34卷第10期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 10    · 1189 ·
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