Page 42 - 中国药房2023年10期
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中心，其持续活化是肝纤维化进展的主要因素                     [3―4] 。近   2 方法
          年来，有学者围绕调控 HSC 活化（如抑制 HSC 增殖、诱                      2.1 细胞培养
          导 HSC 凋亡、调控 HSC 自噬进程等）开展了相关研究，                          取 LO2 和 LX2 细胞，接种于含 10% 胎牛血清的
          以期找到有效的肝纤维化防治药物。研究发现，在肝纤                            DMEM 培养液中，于 37 ℃、5%CO2条件下培养。每 2 d
          维化恢复期，HSC数量的减少主要是通过细胞凋亡信号                           更换1次培养液，取对数生长期细胞进行后续实验。
          实现的 。可见，抑制 HSC 活化和增殖是逆转肝纤维化                         2.2 柚皮素对细胞增殖抑制率影响的检测
                [5]
          的重要机制，诱导活化HSC凋亡也可能是逆转肝纤维化                               采用MTT法进行检测。按“2.1”项下方法体外培养
          的重要策略。                                              LO2和LX2细胞，取培养4～5 d且处于对数生长期的细
              柚皮素（naringenin）是一种广泛存在于柑橘类水果                    胞，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液稀释制得细胞
                                                        [4]
          中的天然黄酮类成分，在葡萄柚中的含量最为丰富 。                            悬液。取上述细胞悬液，按每孔1×10 个（每孔100 μL）
                                                                                              4
                                  [6]
                                          [7]
          研究显示，柚皮素具有抗炎 、抗氧化 等一系列生物效                           接种于 96 孔板中，于 37 ℃、5%CO2条件下培养 24 h，分
                           [8]
                                        [9]
          应，还具有改善肥胖 和代谢综合征 的作用。本课题组                           别用不同浓度（2、5、10、20、40 μmol/L）的柚皮素干预，
          一直致力于研究中药及其活性成分对肝纤维化等慢性                             每浓度设置6个复孔，同时设置不含细胞、不含药物的调
          肝病的防治作用，前期体内预实验结果显示，柚皮素对                            零组和不含药物的空白对照组。培养24 h后，弃去上清
          四氯化碳（CCl4 ）致肝纤维化有抑制作用，因此本研究拟                        液，每孔加入 DMEM 培养液 180 μL 和 5 mg/mL 的 MTT
          从体外细胞分子水平出发，基于凋亡信号探讨柚皮素对                            溶液 20 μL，37 ℃温育 4 h 后，弃去上清液，每孔加入二
          肝纤维化关键中枢HSC活化的抑制作用及可能机制，旨                           甲基亚砜 150 μL，摇匀。使用多功能酶标仪在 490 nm
          在为寻找有效的抗肝纤维化药物提供参考。                                 波长处检测每孔的吸光度，并计算增殖抑制率：增殖抑
          1 材料                                                制率＝（空白对照组吸光度－实验组吸光度）/（空白对照
          1.1 主要仪器                                            组吸光度－调零组吸光度）。
                                                              2.3 柚皮素对LX2细胞肝纤维化标志物蛋白表达影响
              Varioskan LUX型多功能酶标仪、Thermo 311型CO2
          细胞培养仪均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；                            的检测
          IX53型光学显微镜购自日本Olympus公司；5200型全自                     2.3.1 Western blot实验 取对数生长期的LX2细胞，按
                                                                       6
          动化学发光成像分析系统购自上海天能科技有限公司；                            每孔 1×10 个（每孔 2 mL）接种于 6 孔板中，于 37 ℃、
          qTOWER3G 型 荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应（quantitative         5%CO2 条件下培养 24 h，分别用不同浓度（10、20、40
          PCR，q-PCR）仪购自德国Analytik Jena AG公司。                  μmol/L，浓度按“2.2”项下实验结果设置，下同）的柚皮
          1.2 主要药品与试剂                                         素干预，每浓度设置3个复孔，同时设置不含药物的空白
              柚皮素对照品（批号MUAT-21032406，纯度98%）购                  对照组。培养 24 h 后，收集各组细胞并提取蛋白，电泳
          自成都曼斯特生物科技有限公司；凋亡抑制剂 Z-VAD-                         分离后转移至聚偏二氟乙烯膜上，用 5% 脱脂奶粉室温
          FMK（FMK，批号 HY-16658B）、铁死亡通路抑制剂 fer‐                 封 闭 2  h；以 TBST 缓 冲 液 洗 膜 ，加 入 collagen  Ⅰ 、
          rostatin-1（F1，批号HY-100579）、程序性死亡通路抑制剂               α-SMA、β-actin 一抗（稀释比例均为 1∶1 000），4 ℃孵育
          necrostatin-1（NEC-1，批号 HY15760）均购自美国 Med‐           过夜；以 TBST 缓冲液洗膜，加入山羊抗兔 IgG 二抗（稀
          Chem Express 公司，浓度均为 10 μmol/L；胎牛血清和                释比例为 1∶10 000），室温孵育 2 h；以 TBST 缓冲液洗
          DMEM 培养液均购自美国 Gibco 公司；RIPA 裂解液、十                   膜，用 ECL 化学发光底物显影液进行显色，置于全自动
          二烷基硫酸钠（sodium laurylsulfonate，SDS）、牛血清白             化学发光成像分析系统下曝光成像并使用Image J 1.53e
          蛋白（bovine serum albumin，BSA）均购自北京兰杰柯科               软件进行分析。以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度
          技有限公司；台盼蓝、JC-1 试剂盒均购自江苏凯基生物                         值比值表示目的蛋白的表达水平。实验重复3次。
          技术股份有限公司；兔源β-肌动蛋白（β-actin）、α-平滑肌                    2.3.2 免疫荧光实验 将经 75% 乙醇浸泡（30 min）过
          肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）多克隆抗体均             的玻片置于24孔板中，加入含2×10 个LX2细胞的悬液
                                                                                            5
          购自武汉爱博泰克生物科技有限供公司；兔源胶原蛋白                            2 mL。待细胞贴壁后，用柚皮素（40 μmol/L，设置3个复
          Ⅰ（collagen Ⅰ）、Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶 3（caspase-3）、         孔）干预，同时设置不含药物的空白对照组。培养 24 h
          剪切的胱天蛋白酶 3（cleaved caspase-3）多克隆抗体和                 后，收集各组细胞，以磷酸盐缓冲液清洗5 min×3次，置
          山羊抗兔IgG二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司。                           于 4% 多 聚 甲 醛 溶 液 中 固 定 ，37  ℃ 孵 育 30  min，以
          1.3 细胞株                                             0.1%TritonX-100 溶 液 在 室 温 下 通 透 10  min，用 含
              人正常肝细胞 LO2 和人 HSC LX2 均购自中国科学                   1%BSA 的磷酸盐缓冲液封片 60 min；加入 collagen Ⅰ、
          院细胞库。                                               α-SMA一抗（稀释比例均为1∶2 000），4 ℃孵育过夜；加


          · 1188 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 10                            中国药房  2023年第34卷第10期
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