Page 37 - 《中国药房》2023年9期
P. 37

物技术有限公司；兔源α-SMA抗体、兔源TLR4抗体、兔                       2.5 心肌组织纤维化和焦亡相关指标mRNA表达的检测
          源NLRP3抗体、兔源caspase-1抗体、兔源GSDMD抗体、                      采用实时荧光定量 PCR 法检测。每组小鼠中随机
          辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊            取5只小鼠的心肌组织（冻存于－80 ℃）作为实验样本，
          抗兔免疫球蛋白 G（Ig G）二抗、HRP 标记的羊抗小鼠                      使用 TRIzol 试剂按照说明书步骤提取总 RNA。使用逆
          IgG 二抗（批号分别为#19245、#14358、#15101、#24232、           转录试剂盒，根据说明书合成 cDNA。使用 SYBR Tag
          #39754、#7074、#7076）均购自美国 CST 公司；兔源甘油               探针试剂盒进行PCR。PCR程序如下：95 ℃预变性30 s；
          醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（批号ab181602）购自美                  95 ℃变性 5 s，60 ℃退火延伸 30～34 s，40 个循环。用
          国 Abcam 公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，         PCR 基因扩增仪分析反应结果，以 β-actin 为内参，采用
          PVDF）膜购自美国Millipore公司；免疫组织化学试剂盒、                   2 －ΔΔCt  法 计 算 每 个 心 肌 组 织 样 本 中 Col  Ⅰ 、α -SMA、
          DAB染色试剂盒（货号分别为SA1028、AR1022）均购自武                   TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA 的表达水平。
          汉博士德生物工程有限公司。                                      引物序列及产物长度见表1。
          2 方法                                                         表1 PCR引物序列及产物长度
          2.1 分组、造模与给药                                        基因         引物序列（5′→3′）                产物长度/bp
              将50只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组                      Col Ⅰ      上游引物：TGAACGTGGTGTACAAGGTC     20
                                                                         下游引物：CCATCTTTACCAGGAGAACCAT   22
          和红景天苷低、中、高剂量组，每组各 10 只。除对照组                         α-SMA      上游引物：GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC  24
          外，其余各组小鼠皮下注射 ISO 5 mg/（kg·d），连续注射                              下游引物：CGTCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC  23
          14 d造模，所有小鼠均造模成功          [18―20] 。自造模之日起，红         TLR4       上游引物：GCCATCATTATGAGTGCCAATT   22
                                                                         下游引物：AGGGATAAGAACGCTGAGAATT   22
          景天苷低、中、高剂量组小鼠每日灌胃红景天苷溶液10、
                                                              NLRP3      上游引物：GCCGTCTACGTCTTCTTCCTTTCC  24
                    [21]
          30、50 mg/kg ，对照组和模型组小鼠每日灌胃生理盐水                                 下游引物：CATCCGCAGCCAGTGAACAGAG   22
          10 mL/kg，均连续灌胃14 d。                                 caspase-1  上游引物：AGAGGATTTCTTAACGGATGCA   22
          2.2 标本采集                                                       下游引物：TCACAAGACCAGGCATATTCTT   22
                                                              GSDMD      上游引物：CTAGCTAAGGCTCTGGAGACAA   22
              末次给药后，小鼠禁食、禁水24 h，腹腔注射2.5%戊                                下游引物：GATTCTTTTCATCCCAGCAGTC   22
          巴比妥钠 45 mg/kg 麻醉。打开小鼠胸腔，取出心脏，分                      β-actin    上游引物：CTACCTCATGAAGATCCTGACC   22
          离多余的血管和脂肪等组织后，将心脏切半，一半心肌                                       下游引物：CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC   22
          组织置于 4% 多聚甲醛中固定保存备用，另一半置于冻                         2.6 心肌组织纤维化和焦亡相关指标蛋白表达及定位
          存管中－80 ℃冻存备用。                                      情况的检测
          2.3 小鼠心肌组织病理变化的观察                                      采用 Western blot 法检测小鼠心肌组织中 Col Ⅰ、
              采用苏木素-伊红（HE）染色法。取出固定在 4% 多                     α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、GSDMD 总蛋白表达
          聚甲醛中的小鼠心肌组织，制成厚度约0.4 μm的石蜡切                        水平。取“2.5”项下每组同一批5只小鼠的心肌组织（冻
          片，经烤片、脱水蜡化后进行HE染色、风干，在显微镜下                         存于－80 ℃）作为实验样本，放入配制好的RIPA缓冲液
          观察并拍照。每个视野随机观察6个胞核居中的纵切面                           中裂解，裂解完成后高速离心，吸取上清液，根据 BCA
          细胞，共随机观察 20 个视野。使用 Image J 软件测量心                   蛋白检测试剂盒说明书测定蛋白浓度，按照 2 μg/μL 的
          肌细胞横径，并计算平均值。                                      蛋白浓度配制上样体系。制备5%浓缩胶+10%分离胶，
          2.4 小鼠心肌组织纤维化程度的观察                                 将样品按10 μL/孔上样。参照抗体说明书进行电泳、转
              采用Masson染色法检测小鼠心肌间质中的胶原沉                       膜、封闭、孵育相应一抗（Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、
          积情况，并观察心肌细胞形态和排列的改变。取“2.3”项                        caspase-1、GSDMD的稀释度均为1∶1 000，GAPDH的稀
          下石蜡切片，按照试剂盒说明书进行Masson染色，在显                        释度为1∶10 000，抗体稀释液为5%BSA）和二抗（稀释度
          微镜下观察并拍照。每张切片随机选取 5 个不重复视                          均为1∶1 000），通过ECL显影液显影，使用Image J软件
          野，采用 Image J 软件计算心肌胶原容积分数（collagen                 对蛋白条带进行量化处理，以目的蛋白与GAPDH（内参）
          volume fraction，CVF），CVF（%）＝心肌胶原面积/所测              条带灰度值的比值表示目的蛋白的总蛋白表达水平。
          视野面积×100%。                                             采用免疫组织化学法检测纤维化和焦亡相关蛋白
              采用Sirius Red染色法进一步检测胶原纤维在小鼠                    在小鼠心肌组织中的定位情况。取“2.5”项下每组同一
          心肌组织中的沉积情况。取“2.3”项下石蜡切片，经常规                        批5只小鼠的心肌组织作为实验样本，经固定、切片、脱
          脱水蜡化、Sirius Red 染色液滴染、蒸馏水清洗、苏木素                    蜡、脱水处理后，用过氧化氢于37 ℃孵育30 min，以5%
          染液染色、95%乙醇脱水、无水乙醇浸泡、二甲苯通透处                         BSA 于 37 ℃恒温封闭 1 h，向每个组织切片滴加 50 μL
          理，最后用中性树胶封片，放通风橱风干后，在显微镜下                          配制好的一抗（Col Ⅰ、α-SMA、TLR4、NLRP3、caspase-1、
          观察并拍照。每张切片随机选取5个不重复视野，采用                           GSDMD 的稀释度分别为 1∶300、1∶300、1∶50、1∶200、1∶
          Image J软件计算CVF，计算方法同前。                             200、1∶50），4 ℃孵育过夜，次日向各切片加入 50 μL 二


          中国药房  2023年第34卷第9期                                                China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 9    · 1055 ·
   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42