Page 26 - 《中国药房》2023年9期
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员会的审核批准（伦理审查号为2022010H1），并且在实                       胞核，经分化透明后用中性树胶封片。切片晾干后在显
          验中严格遵循《实验动物管理条例》。                                   微镜下镜检，进行图像采集分析。
          2 方法                                                2.7 小鼠踝关节软骨组织破坏情况观察
          2.1 G6PI诱导制备RA小鼠模型                                      采用番红固绿染色法进行检测。将“2.4”项下踝关
              将多肽片段 hGPI 325-339 和 hGPI 469-483 各 60 μg       节组织切片置于二甲苯中脱蜡、梯度乙醇水化后，用自
          混合溶解于75 μL超纯水中，将等体积的完全弗氏佐剂                          来水洗 2 min，随后用苏木素染核 1 min，自来水洗及盐
          和溶解后的混合多肽分别吸入2个玻璃注射器内，尽量                            酸酒精分化后用固绿染色 5 min；蒸馏水浸洗 3 次，再用
          排尽注射器内空气并连接三通管，冰上制备乳化剂。将                            番红染色 3 min，经分化透明后用中性树胶封片。切片
          制好的乳化剂于小鼠尾根部皮下多点注射（150 μL/只），                       晾干后在显微镜下镜检，进行图像采集分析。
          随后立即腹腔注射百日咳毒素（300 ng/只）建立 RA 模                      2.8 小鼠血清中IL-6含量检测
          型，注射乳化剂当天记为造模第 0 天。造模后第 2、8 天                           采用 ELISA 法进行检测。将小鼠血液标本于室温
                                              [10]
          分别再次腹腔注射百日咳毒素加强免疫 。关节炎评                             下静置至少 2 h，随后以 3 000 r/min 在 4 ℃下离心 20
                                [11]
          分大于8分即为造模成功 。                                       min，吸取上层血清，按试剂盒说明书相关方法操作，用
          2.2 分组与给药                                           酶标仪测定血清中IL-6的含量。每组随机选取8只小鼠
              采用随机数字表法将70只小鼠随机分成正常组、模                         样本的结果进行统计分析。
          型组、资木瓜总苷低剂量组、资木瓜总苷高剂量组和雷                            2.9 小鼠踝关节组织中TNF-α、IL-4、IL-10含量检测
          公藤多苷片组（阳性对照），每组14只。除正常组外，其                              采用 ELISA 法进行检测。用预冷的磷酸盐缓冲液
          余各组均按“2.1”项下方法制备 RA 模型。各给药组小                       （PBS）清洗小鼠踝关节组织，将 50 mg 踝关节组织置于
          鼠在末次注射百日咳毒素加强免疫后开始给药：资木瓜                            1.5 mL EP管中，加入450 μL PBS，破碎关节组织后离心
          总苷低、高剂量组小鼠分别给予资木瓜总苷 60、240                         （以12 000 r/min在4 ℃离心15 min）提取上清液，然后按
                                                [12]
          mg/kg（剂量根据课题组前期研究结果设置 ）；雷公藤                         照试剂盒说明书相关方法操作，用酶标仪测定小鼠踝关
          多苷片组小鼠给予雷公藤多苷片30 mg/kg（剂量参考文                        节组织中 TNF-α、IL-4、IL-10 的含量。每组随机选取 8
          献[13]设置）。正常组和模型组小鼠给予等体积生理盐                          只小鼠样本的结果进行统计分析。
          水。所有小鼠均采用灌胃的方式，每天1次，连续13 d。                         2.10 小鼠踝关节组织中 RANKL/RANK/OPG 信号通
          2.3 小鼠关节红肿及一般状态观察                                   路相关蛋白表达水平检测
              造模后，观察小鼠关节红肿和一般状态，每组选择                              采用 Western blot 法进行检测。用预冷的 PBS 冲洗
          12只小鼠进行后续实验。统计小鼠一般情况，剔除组内                           小鼠踝关节组织，称取50 mg组织于1.5 mL EP管中，加
          差异较大的数据，每组选取12只小鼠进行统计。                              入 1 mL PBS，剪碎关节组织并离心（以 12 000 r/min 在
          2.4 小鼠体质量、后足趾厚度、关节炎评分检测及取材                          4 ℃离心 10 min），弃上清液。向组织沉淀中加入 450
              多肽造模后，每隔1天测量并记录1次小鼠体质量、                         μL RIPA 裂解液，匀浆后离心（以 12 000 r/min 在 4 ℃离
          左和右后足趾厚度，同时对小鼠的四肢足趾进行关节炎                            心 10 min），取上清液。用二喹啉甲酸（BCA）法检测上
          评分。关节炎评分以0～4分记录，四肢足趾得分累积相                           清液中总蛋白浓度，取30 μg变性后的蛋白上样，行十二
                                                    [14]
          加即得到每只小鼠的关节炎评分，最高分为16分 。具                           烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电泳时间为80 min，
          体评分细则如下：0分，关节正常，无明显红肿；1分，足趾                         电压为 80、110 V），电泳完后转膜至聚偏二氟乙烯
          轻度红肿；2分，脚掌红肿；3分，脚踝严重肿胀和发红；4                        （PVDF）膜 上（转 膜 时 间 为 90  min，转 膜 电 流 为 250
          分，全腿和所有足趾严重肿胀、变形或强直，无承重能                            mA），用 5% 脱脂牛奶封闭 1 h；加入 β-actin（内参）、
          力。在多肽造模后第21天时处死小鼠，采集小鼠血液标                           RANKL、RANK、OPG、TRAF6、NFATC1一抗（稀释比例
          本及踝关节组织样本，备用。                                       均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；以TBST缓冲液洗膜3次，
          2.5 小鼠踝关节组织病理形态学变化观察                                加入二抗（稀释比例均为 1∶3 000），室温孵育 1 h；TBST
              采用苏木精-伊红（HE）染色法进行检测。取小鼠新                        洗膜 3 次，用 ECL 化学发光法显色成像，使用 Image J
          鲜踝关节组织，经固定、脱钙、脱水、包埋、切片（片厚 4                         1.42q软件分析条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与
          μm）、烤片后，常规进行 HE 染色，再用中性树胶封片。                        内参 β-actin 蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的表
          将切片晾干后在显微镜下镜检，进行图像采集分析。                             达水平，并以正常组结果为1对各组蛋白表达结果进行
          2.6 小鼠踝关节组织中破骨细胞活化情况观察                              归一化处理。每组随机选取3只小鼠样本的结果进行统
              采用 TRAP 染色法进行检测。将“2.4”项下踝关节                     计分析。
          组织切片置于二甲苯中脱蜡、梯度乙醇水化，随后蒸馏                            2.11 统计学方法
          水洗2 min，用TRAP固定液在4 ℃下固定1 min，然后加                        采用 GraphPad Prism 8 软件及 Image J 1.42q 软件对
          入TRAP孵育液在37 ℃下孵育45 min，再用甲基绿染细                      数据进行处理。计量资料满足正态分布以x±s表示，多


          · 1044 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 9                              中国药房  2023年第34卷第9期
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