Page 64 - 《中国药房》2023年7期

20 μmol/L DP， HL60 cells showed typical morphological characteristics of apoptosis； DP could significantly increase the levels of
LDH release and the activities of caspase-3 and caspase-9 （P＜0.05 or P＜0.01）， in dose-dependent manner. After treatment of 10
μmol/L DP and 10 μmol/L DP+LY294002， the transcriptional levels of caspase-3， caspase-9 and Bim mRNA were increased
significantly （P＜0.05 or P＜0.01）， and transcriptional level of FoxO3a mRNA and protein expressions of p-FoxO3a and p-Akt
were decreased significantly （P＜0.05 or P＜0.01）. Nuclear translocation changes were observed in FoxO3a protein in 10 μmol/L
DP+LY294002 group， and the change was more significant than that of LY294002 group. CONCLUSIONS DP can inhibit the
proliferation and induce the apoptosis of HL60 cells via inhibiting PI3K/Akt signaling pathway.
KEYWORDS Euphorbia fischeriana； 12-deoxyphorbol-13-palmitate； human myeloid leukemia HL60 cells； phosphoinositide 3-
kinase/protein kinase B signaling pathway

白血病是造血系统最常见的恶性肿瘤，发病率和病 国 Thermo Fisher Scientific 公司），Spark 型酶标仪（瑞士
[1]
死率均较高 。研究表明，我国白血病发病率居各类型 Tecan公司），Observer A1型荧光显微镜、LSM710型激光
肿瘤的第 6 位，位居儿童恶性肿瘤首位，已成为儿童死 共聚焦显微镜（德国CarlZeiss公司），FACSCallbur型流式
[2]
亡的主要原因之一 。急性髓系白血病是白血病中常见 细胞仪（美国BD公司），Q5型实时荧光定量-聚合酶链式
的类型，发病率约为 70％，占小儿白血病发病例数的 反应（PCR）仪（美国 Applied Biosystems 公司），Biospec-
[3]
30％ 。虽然急性髓系白血病患者在接受全反式维甲酸 nano型微量紫外分光光度计（日本Shimadzu公司）。
和三氧化二砷等靶向治疗后的治愈率较高，但治疗后易 1.2 主要药品与试剂
[3]
复发，严重影响了患者的疗效和预后 。有研究报道，磷 DP 由齐齐哈尔医学院天然药物实验中心提供，经
脂酰肌醇 3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白 高效液相色谱法测定其纯度≥98%，在4 ℃保存，使用时
激酶 B（protein kinase B，Akt）信号通路对细胞的生长、 用二甲基亚砜（DMSO）调成所需质量浓度。AO-EB 染
存活、增殖及凋亡均有调控作用，该通路的异常激活与人 色试剂盒（批号DA26FA0002）购自生工生物（工程）上海
白血病特别是急性淋巴细胞白血病的发生发展密切 股份有限公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；IMDM
相关 [4―5] 。 培养基购自安徽白鲨生物科技有限公司；乳酸脱氢酶
狼毒大戟为大戟科草本植物狼毒大戟 Euphorbia
（lactate dehydrogenase，LDH）活 性 检 测 试 剂 盒（批 号
fischeriana Steud. 的根，其野生品种在黑龙江省山区草
20180708）购自南京建成生物工程研究所；Annexin Ⅴ-
原广泛分布，药源充足。作为传统的毒性中草药，其味
FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（批号4293719）购自美国BD
辛，性平，具有逐水祛痰、散结杀虫等多种药理活性，多
公司；胱天蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase
[6]
用于水肿、腹水、肝癌、肺癌等疾病的治疗 。12-去氧佛
3，caspase-3）、caspase-9酶活性检测试剂盒（批号分别为
波醇-13-棕榈酸酯（DP）是从狼毒大戟中分离出的一种
042821211029、042621211036）购自上海碧云天生物技
四环二萜类单体化合物，分子式为C36H58O6，化学结构见
术有限公司；实时荧光定量-PCR试剂盒、Trizol试剂（批
图1。本课题组前期研究发现，DP在体外能抑制人原髓
号分别为 AK6002、AI51028A）购自宝生物工程（大连）
细胞白血病细胞HL60增殖并诱导其凋亡 ，但具体的作
[7]
有限公司；兔抗人磷酸化 Akt（p-Akt）单克隆抗体、工具
用机制还不清楚。本研究拟通过体外实验探究DP能否
药 LY294002（PI3K 特异性抑制剂）、兔抗人甘油醛-3-
通过PI3K/Akt信号通路抑制HL60细胞增殖并诱导其凋
磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、辣根过氧化物酶
亡，为将其开发成抗白血病新药提供实验依据。
标 记 的山羊抗兔 IgG 二抗均购自美国 Cell Signaling
Technology 公司；兔抗人叉头框 O3a（forkhead box O3a，
FoxO3a）、磷酸化FoxO3a（p-FoxO3a）单克隆抗体购自美
国 Abcam 公司；caspase-3、caspase-9、FoxO3a、B 细胞淋
巴瘤 2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）细胞死亡的相互作用
介质（Bim）、β-肌动蛋白（β-actin）的 PCR 序列均由生工
生物工程（上海）股份有限公司设计、合成。
图 1 DP的化学结构
1.3 细胞株
1 材料 人原髓细胞白血病细胞HL60购自中国科学院上海
1.1 主要仪器 细胞库，以液氮保存于齐齐哈尔医学院医药科学研究所
本研究所用的主要仪器有3111型CO2细胞培养箱（美 实验室中。

· 826 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 7 中国药房 2023年第34卷第7期