Page 65 - 《中国药房》2023年7期
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2 方法                                               定:细胞准备、实验分组、给药同“2.4”项下。收集培养
          2.1 细胞培养                                           24 h 的细胞于 EP 管中,加 PBS 重悬,离心(200×g,3
              将 HL60 细胞复苏后接种于培养瓶中,用含 20% 胎                   min)并弃上清;向各EP管中加100 μL蛋白裂解液,在冰
          牛血清的 IMDM 培养基进行培养。将细胞置于 37 ℃、                      浴上裂解 15 min(每 5 min 混匀一次各 EP 管),离心
          5%CO2培养箱中,平均2 d传代1次。                              (4 ℃,12 000×g)15 min,用加样枪抽取各组细胞上清
          2.2 细胞增殖能力检测                                       液,备用。按照相应试剂盒说明书操作,检测细胞中cas‐
              采用 MTT 法进行检测。取对数生长期细胞,调整                       pase-3、caspase-9活性。上述实验均重复3次。
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          细胞密度为2×10 个/mL,按每孔0.2 mL接种到96孔细                    2.6 细胞中 caspase-3、caspase-9、FoxO3a、Bim mRNA
          胞培养板中。实验分组如下:空白对照组、DP 10 μmol/L                    转录水平测定
            [7]
          组 、LY294002 组(40 μmol/L,按照试剂说明书设置)、                    采用实时荧光定量-PCR法进行检测。取对数生长
          DP10  μmol/L+LY294002 组(10  μmol/L  DP+40  μmol/L   期细胞,调整细胞密度为 2×10 个/mL。细胞接种、分
                                                                                         4
          LY294002,LY294002在DP作用结束前1 h加入,并按试                 组、给药均同“2.2”项下。作用 24 h 后,收集各组细胞至
          剂说明书设置浓度),每个组设3个复孔。将培养板置于                          EP 管中,加 PBS 重悬,离心(300 × g)10 min 并弃上清;
          培养箱中常规培养,培养24 h后取出96孔板,每孔加入                        每管加入 Trizol 试剂 1 mL,待细胞充分溶解后,提取各
          MTT溶液(5 g/L)20 μL,放入培养箱中继续培养4 h后,                  组细胞的总RNA,并在微量紫外分光光度计上测定其浓
          离 心(300×g,10  min)并 弃 上 清 ,每 孔 加 入 150  μL         度及纯度;然后按照试剂盒说明书方法,首先将RNA逆
          DMSO溶解甲瓒,采用酶标仪测定各孔在490 nm波长处                       转录合成 cDNA,再以 cDNA 为模板进行 PCR 反应。按
          的吸光度(OD),根据公式计算细胞的增殖抑制率:增殖                         照试剂盒说明书设置仪器的扩增条件:95 ℃预变性 30
          抑制率(%)=(1-用药组OD平均值/空白对照组OD平                        s;95 ℃变性 5 s,60 ℃退火/延伸 31 s,共 40 个循环。扩
          均值)×100%。实验重复3次。                                   增体系(共 25.0 μL)如下:TB green 12.5 μL,上、下游引
          2.3 细胞凋亡检测                                         物各 0.5 μL,cDNA 模板 2.0 μL,50×Rox Dye 0.5 μL,
              采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色法进行检测。取对                 RNase-free水9.0 μL。以β-actin为内参,采用2       -△△Ct 法检
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          数生长期细胞,调整细胞密度为 2×10 个/mL,按每孔 2                     测各目标基因的相对表达量。引物序列及扩增产物长
          mL接种到6孔板中,实验分组、给药同“2.2”项下。药物                       度见表1。实验重复3次。
          作用24 h后,离心(200×g,10 min)并收集细胞于流式管                            表1 引物序列及扩增产物长度
          中,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次,然后按试剂盒说明书                         基因名称                引物序列              扩增产物长度/bp
          方法操作:每管加入 300 μL 结合缓冲液,随后添加 An‐                     β-actin       上游:5′-GTTGTCGACGACGAGCG-3′    93
          nexin Ⅴ-FITC 染液、PI 染液各 5 μL,室温避光孵育 10                             下游:5′-GCACAGAGCCTCGCCTT-3′
                                                              caspase-3     上游:5′-TCGCTTCCATGTATGATCTTTG-3′  110
          min,最后上机检测细胞凋亡情况。细胞凋亡率结果以                                         下游:5′-CTGCCTCTTCCCCCATTCT-3′
          早期凋亡率(右下象限)和晚期凋亡率(右上象限)的总                           caspase-9     上游:5′-CATGCTCAGGATGTAAGCCA-3′    93
                                                                            下游:5′-AGGTTCTCAGACCGGAAACA-3′
          和表示。
                                                              FoxO3a        上游:5′-AGTTCCCTCATTCTGGACCC-3′  102
          2.4 细胞形态学观察                                                       下游:5′-CTTCAAGGATAAGGGCGACA-3′
              采用AO-EB染色法进行观察。取对数生长期细胞,                        Bim           上游:5′-GATAGTGGTTGAAGGCCTGG-3′  102
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          调整细胞密度为 2×10 个/mL,按每孔 2 mL 接种到 6 孔                                下游:5′-CCTCCCTACAGACAGAGCCA-3′
          板中。实验分为空白对照组和 DP 不同浓度(5、10、20                      2.7 细胞中p-FoxO3a、p-Akt蛋白表达水平测定
                [7]
          μmol/L )组。DP 作用细胞 24 h 后,离心(300×g,10                   采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期细
                                                                                     4
          min)并 弃 掉 培 养 基 ,用 PBS 洗 2 次 ,然 后 再 次 离 心          胞,调整细胞密度为 2×10 个/mL,将细胞接种于 100
         (300×g,10 min)并弃上清。按AO-EB染色试剂盒说明                    mm细胞培养皿中(每皿8 mL),实验分组和细胞给药同
          书方法操作进行染色,然后于荧光显微镜下观察细胞形                          “2.2”项下。培养24 h后,收集各组细胞于EP管中,PBS
          态学变化并拍照。                                           洗涤,然后每管加入1.5 mL含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂
          2.5 细胞培养液中 LDH 释放量和细胞中 caspase-3、                  的蛋白裂解液,提取细胞中总蛋白,按照BCA试剂盒说
          caspase-9活性测定                                      明书方法对总蛋白进行定量。取 20 μg 高温变性的蛋
              采用ELISA法进行检测。(1)细胞培养液中LDH释                     白,上样十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压 80
          放量检测:细胞准备、实验分组、给药均同“2.4”项下。培                       V,时间2 h),然后电转至聚偏氟乙烯膜上(300 mA恒流
          养24 h后,用加样枪抽取各组细胞上清液100 μL备用;                      转印 2 h)。将载有蛋白的膜经 5% 脱脂奶粉室温封闭
          按 LDH 试剂盒说明书方法操作并计算细胞培养液中                          1.5 h,用TBST缓冲液(含1%聚山梨酯20,下同)洗膜3次
          LDH 的释放量。(2)细胞中 caspase-3、caspase-9 活性测           (10 min/次),加入一抗 GAPDH(稀释比例为 1∶1 000)、


          中国药房  2023年第34卷第7期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 7    · 827 ·
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