Page 66 - 《中国药房》2023年7期

p-FoxO3a（稀释比例为 1∶2 000）、p-Akt（稀释比例为 1∶ 亡率[（13.79±2.07）%、（23.86±1.78）%]显著升高（P＜
1 000），4 ℃孵育过夜；TBST缓冲液洗膜3次（10 min/次）， 0.01），但 LY294002 组细胞凋亡率[（7.82±2.34）%]的差
加入二抗（稀释比例为 1∶2 000），室温孵育 1.5 h；TBST 异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图2。
缓冲液洗膜 3 次（10 min/次），滴加 ECL 发光液，于全自 HL60.001 HL60.002
10 4 10 4
动荧光及化学发光成像系统上曝光获取图片。采用仪
器自带软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度 10 3 10 3
值与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比值来表示目的 Propidium Iodide 10 2 Propidium Iodide 10 2
蛋白的表达水平。实验重复3次。 10 1 10 1
2.8 细胞中FoxO3a蛋白核转位情况观察 10 0 10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
4
取对数生长期细胞，调整细胞密度为2×10 个/mL。 FL1-Height FL1-Height
取 1 mL 含细胞的完全培养基接种到共聚焦显微镜专 A.空白对照组 B. DP 10 μmol/L组
HL60.003 HL60.004
用 24 孔细胞培养板（黑壁底透）上，实验分组如下：空 10 4 10 4
白对照组、LY294002 组（40 μmol/L）和 DP 10 μmol/L+ 10 3 10 3
LY294002 组（10 μmol/L DP+40 μmol/L LY294002， Propidium Iodide 10 2 Propidium Iodide 10 2
LY294002在药物作用结束前1 h加入）。将细胞放入培 10 1 10 1
养箱中常规孵育 24 h 后，离心（300×g，10 min）并弃上 10 0 10 0
清，加入4%多聚甲醛，在室温下固定30 min，采用Triton 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
FL1-Height FL1-Height
X-100 免疫染色通透液在室温下通透 30 min 后，再用含 C. LY294002组 D. DP 10 μmol/L+LY294002组
1% 牛血清白蛋白的 PBS 在 37 ℃下封闭 30 min，随后加 图2 各组细胞凋亡检测的流式细胞图
入 FoxO3a 一抗（稀释比例为 1∶500）在 4 ℃冰箱中孵育
3.3 细胞形态学观察结果
过夜；将孔板洗涤、离心（300×g，10 min）并弃上清，加入
空白对照组细胞生长旺盛，呈重叠样增殖，并可见
二抗（稀释比例为1∶1 000）并在室温下避光孵育60 min；
均匀的绿色荧光；5、10、20 μmol/L DP作用24 h后，细胞
加入二脒基苯基吲哚（DAPI）染液在室温下孵育15 min，
形态发生变化，表现为红色荧光逐渐增强，细胞数量减
对细胞核进行染色。染色结束后，于激光共聚焦显微镜
少、轮廓模糊不清，可见较多的细胞碎片，且随着药物浓
下观察并记录各组细胞的形态变化以及荧光蛋白表达
度的增大上述变化更明显。结果见图3。
位置的变化并拍照，拍照时将激光强度调成一致，蛋白
3.4 细胞培养液中 LDH 释放量和细胞中 caspase-3、
阳性表达呈红色荧光。
caspase-9活性测定结果
2.9 统计学方法
与空白对照组比较，DP 5、10、20 μmol/L 组细胞培
采用 SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料以
养液中 LDH 释放量和细胞中 caspase-3、caspase-9 活性
x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），且均具有一定的浓度
比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
依赖性趋势。结果见表3。
3 结果
3.5 细胞中 caspase-3、caspase-9、Bim、FoxO3a mRNA
3.1 细胞增殖抑制率测定结果
转录水平测定结果
与空白对照组比较，DP 10 μmol/L组、DP 10 μmol/L+
与空白对照组比较，DP 10 μmol/L 组、LY294002
LY294002 组细胞的增殖均受到显著抑制（P＜0.01），且
组、DP 10 μmol/L+LY294002 组细胞中 caspase-3、cas‐
DP 10.0 μmol/L +LY294002 组的抑制效果优于 DP 10
pase-9、Bim mRNA 的转录水平均显著升高（P＜0.05 或
μmol/L组。结果见表2。
P＜0.01），FoxO3a mRNA的转录水平显著降低（P＜0.05
表2 各组细胞的增殖抑制率测定结果（x±s，n＝3）
或 P＜0.01），且 DP 10 μmol/L+LY294002 组的效果在一
组别 OD值 抑制率/%
空白对照组 1.416±0.073 定程度上优于DP 10 μmol/L组。结果见表4。
DP 10 μmol/L组 1.122±0.077 a 20.79 3.6 细胞中p-FoxO3a、p-Akt蛋白表达水平测定结果
LY294002组 1.268±0.050 9.18
DP10 μmol/L+LY294002组 0.899±0.059 a 36.49 与空白对照组比较，DP 10 μmol/L组、DP 10 μmol/L+
a：与空白对照组比较，P＜0.01 LY294002 组细胞中 p-FoxO3a、p-Akt 蛋白的表达水平
3.2 细胞凋亡率测定结果 均 显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），且 DP 10 μmol/L+
与空白对照组[细胞凋亡率（3.22±1.07）%]比较， LY294002 组的效果较 DP 10.0 μmol/L 组更明显。结果
DP 10 μmol/L 组、DP 10 μmol/L+LY294002 组细胞的凋 见图4、表5。

· 828 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 7 中国药房 2023年第34卷第7期