Page 59 - 《中国药房》2023年7期
P. 59

模 ，具体方法如下：IgAN 模型组和大黄酸治疗组大鼠                        25 min，再以PBS浸泡3次，10%正常山羊血清室温封闭
            [13]
          隔日灌胃 BSA （400 mg/kg），连续 6 周，第 6 周和第 8 周            非特异性抗体 30 min；加入 IL-17、IL-6、TGF-β 抗体（稀
                                                             释度均为 1∶200），4 ℃孵育过夜；次日以 PBS 浸泡 3 次，
          尾静脉注射 LPS 各 1 次（0.05 mg/次），另皮下注射 CCl4
         （0.1 mL/次）、蓖麻油（0.5 mL/次），每周 1 次，连续 9 周；             加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育 1 h；以 PBS
          正常对照组大鼠用等量生理盐水代替造模药物。从第7                           浸泡 3 次，DAB 显色液显色，当在光学显微镜下看到棕
          周开始，大黄酸治疗组大鼠每天灌胃大黄酸（100 mg/kg，                     黄色沉淀时，将切片放在纯水中终止显色；以苏木素复
          剂量参考文献[9]设置），连续 4 周；正常对照组和 IgAN                    染 3 min，流水洗 1 min，分化液分化数秒，自来水蓝化 1
          模型组大鼠灌胃等量生理盐水，其余操作不变。第10周                          min，再脱水、透明、封片。采用光学显微镜随机选取6个
          末取材。                                               视野拍照，并用图像分析系统分析每个视野的积分光密
          2.2 大鼠尿红细胞数、24 h-UTP的检测                            度值。当切片中出现棕黄色或棕褐色颗粒时则为相应
              第10周末用揉腹法采集大鼠新鲜尿液，并于显微镜                        蛋白的阳性表达。
          下使用血球计数板进行尿红细胞计数；然后将各组大鼠                           2.7 大鼠小肠黏膜 Peyer 结中 STAT3、RORγt mRNA
          放至代谢笼中，采集其 24 h 尿液，应用酶标仪和相应试                       表达水平的检测
          剂盒测定24 h-UTP。                                          采用 RT-PCR 法进行检测。每组随机选取 6 只大鼠
          2.3 大鼠血清中IgA和小肠黏液中sIgA水平的检测                        的小肠黏膜Peyer结于研磨钵中磨粉，采用Trizol法提出
              上述实验结束后，腹腔注射 1% 戊巴比妥钠（40                       总 RNA 并测定其含量。取总 RNA 2 μg 按逆转录试剂
          mg/kg）麻醉大鼠，然后在解剖板上进行腹主动脉取血。                        盒说明书方法操作获得 cDNA。以 cDNA 为模板进行
          将血样室温静置 20 min 左右，以 3 000 r/min 离心 10              PCR，具体反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，
          min，收集上清液，备用。另处死大鼠，剖取肾皮质，部分                        60 ℃退火延伸 30 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参，
          放入 4% 多聚甲醛溶液中固定，部分放入液氮中保存备                         采用2  －ΔΔCt 法计算各目的基因的表达水平。本研究所用
          用；剖取小肠黏膜 Peyer 结，部分放入 4% 多聚甲醛溶液                    引物由武汉赛维尔生物科技有限公司设计合成，具体信
          中固定，部分置于－80 ℃冰箱中保存备用，部分用盖玻                         息见表1。
          片刮取肠黏液保存备用。根据 ELISA 试剂盒说明书方                                表1 PCR引物序列与扩增产物长度
          法测定大鼠血清中IgA和小肠黏液中sIgA水平。                            基因          序列（5′→3′）                 扩增产物长度/bp
                                                              GAPDH       上游：CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG    138
          2.4 大鼠肾皮质和小肠黏膜 Peyer 结的病理形态学                                    下游：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT
          观察                                                  STAT3       上游：TTAACATTCTGGGCACGAACA     147
                                                                          下游：TGACAATCAAGGAGGCATCAC
              取各组大鼠固定于4%多聚甲醛溶液中的肾皮质和
                                                              RORγt       上游：CAAGAAAAGAGGAGAGTGGAGCA   169
          小肠黏膜 Peyer 结适量，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切                                   下游：GGAGGTGCTGGAAGTCCTGTAG
          片后，进行 HE 染色。每张切片取任意 5 个高倍镜视野                       2.8 大鼠小肠黏膜 Peyer 结中 p-STAT3 和 RORγt 蛋白
         （×400），通过 Katafuchi 评分对肾皮质切片中肾小体增                   表达水平的检测
          大、肾小囊扩张、肾小管肿胀阻塞、球内系膜增生和纤维                              采用 Western blot 法进行检测。每组随机选取 6 只
                              [14]
          化情况进行半定量分析 。                                       大鼠的小肠黏膜 Peyer 结提取总蛋白，并测定其浓度。
          2.5 大鼠肾皮质中IgA沉积情况观察                                取50 µg 总蛋白，100 ℃变性5 min，冷却至室温，进行十
              采用免疫荧光法进行观察。取大鼠肾皮质制备冰                          二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜；5%BSA封闭
          冻切片，室温晾干后，固定在 4% 多聚甲醛溶液中 10                        2 h，加入p-STAT3一抗（稀释度为1∶1 000）、RORγt一抗
          min，晾干，置于湿盒；以磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡 3 次，                   （稀释度为 1∶500）、β-actin 一抗（稀释度为 1∶2 000）于
          以10%正常山羊血清常温封闭20 min，再于4 ℃条件下                      4 ℃孵育过夜；次日洗膜后加入二抗（稀释度为1∶5 000），
          以 FITC 标记的山羊抗大鼠 IgA 抗体（稀释度为 1∶100）                 37 ℃孵育 1 h；采用 ECL 法显色，并用 Image J 软件分析
          孵育过夜；次日以PBS浸泡3次，晾干封片，置于荧光显                         各条带的灰度值，以目的蛋白与内参β-actin的灰度值比
          微镜下观察，并参考文献[15]进行荧光半定量分级。                          值表示其蛋白表达水平。
          2.6 大鼠小肠黏膜 Peyer 结中 IL-17、IL-6 和 TGF-β 表           2.9 统计学方法
          达水平的检测                                                 采用 SPSS 23.0 软件分析数据，数据用 x±s 表示。
              采用免疫组化法进行检测。取大鼠小肠黏膜Peyer                       多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用
          结适量进行石蜡包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复；以                           LSD-t 检验，等级分组资料采用 Kruskal-Wallis 秩和检
          PBS 浸泡 3 次，3%H2O2室温避光灭活内源性过氧化物                     验。检验水准α＝0.01。


          中国药房  2023年第34卷第7期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 7    · 821 ·
   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64