Page 76 - 《中国药房》2023年6期
P. 76
质量浓度均为1.00 mg/mL的单一对照品溶液。 项下检测条件进样分析，记录峰面积。以待测成分的质
2.2.2 内标工作液 精密称取内标对照品，用 0.2% 甲 量浓度为横坐标（x）、待测成分与内标的峰面积比值为
2
酸溶液溶解并定容，制得内标质量浓度为1.00 mg/mL的 纵坐标（y），采用加权最小二乘法（权重系数为1/x）进行
储备液；取上述储备液适量，用 0.2% 甲酸溶液稀释，制 线性回归。结果显示，多黏菌素 B1 的回归方程为 y＝
得质量浓度为5 000 ng/mL的内标工作液。 0.000 783x－0.009 61（r＝0.997 8），检测质量浓度的线
2.2.3 标准曲线血浆样品和质控血浆样品 取“2.2.1” 性范围为 200～20 000 ng/mL，定量下限为 200 ng/mL；
项下各单一对照品溶液，用0.2%甲酸溶液稀释，制得多 多黏菌素 B2 的回归方程为 y＝0.001 96x+0.010 1（r＝
黏菌素 B1 质量浓度分别为 5.00、10.0、25.0、50.0、100、 0.995 6），检测质量浓度的线性范围为50～5 000 ng/mL，
250、500 mg/L 和多黏菌素 B2 质量浓度分别为 1.25、 定量下限为50 ng/mL。
2.50、6.25、12.5、25.0、62.5、125 mg/L的标准系列溶液，以 2.4.3 精密度与准确度试验 取“2.2.3”项下定量下限
及多黏菌素 B1 质量浓度分别为 5.00、10.0、50.0、400 质量浓度（多黏菌素 B1、B2 质量浓度分别为 200、50
mg/L 和多黏菌素 B2 质量浓度分别为 1.25、2.50、12.5、 ng/mL）和低、中、高质量浓度（多黏菌素 B1 质量浓度分
100 mg/L 的质控溶液。取上述标准系列溶液和质控溶 别为 400、2 000、16 000 ng/mL，B2 为 100、500、4 000
液 20 μL，加入空白血浆 480 μL，制得多黏菌素 B1 质量 ng/mL，下同）的质控血浆样品，各质量浓度平行5份，按
浓度分别为 200、400、1 000、2 000、4 000、10 000、20 000 “2.3”项下方法处理后，再按“2.1”项下检测条件进样分
析，考察日内精密度；连续测定 3 d，考察日间精密度。
ng/mL 和多黏菌素 B2 质量浓度分别为 50、100、250、
将实测质量浓度与理论质量浓度进行比较，以相对误
500、1 000、2 500、5 000 ng/mL 的系列标准曲线血浆样
差（relative error，RE）考察准确度。结果显示，多黏菌
品，以及多黏菌素 B1 质量浓度分别为 200、400、2 000、
素 B1 日内（n＝5）、日间（n＝15）精密度的 RSD 均不高
16 000 ng/mL 和多黏菌素 B2 质量浓度分别为 50、100、
于7.21%，RE为－8.30%～3.38%；多黏菌素B2日内（n＝
500、4 000 ng/mL的质控血浆样品。
5）、日间（n＝15）精密度的 RSD 均不高于 12.06%，RE
2.3 血浆样品预处理方法
为－10.88%～－1.20%。结果见表1。
取血浆样品 200 μL，加入“2.2.2”项下内标工作液
2.4.4 提取回收率 取“2.2.3”项下低、中、高质量浓度
20 μL，加入 5% 三氯乙酸溶液 150 μL，混匀 2 min，以
质控血浆样品，各质量浓度平行 5 份，按“2.3”项下方法
15 000 r/min 离心 20 min，取上清液 120 μL，加入水（含
处理后，再按“2.1”项下检测条件进样分析，记录峰面积
0.5%甲酸）360 μL稀释，再次混匀2 min，以15 000 r/min
（A）。另取空白血浆，按“2.3”项下方法处理（不加内标）
离心5 min，取上清液进样测定。
后，取上清液作为空白基质，加入一定质量浓度的多黏
2.4 方法学考察
菌素B1、B2对照品溶液和内标工作液，使最终质量浓度
参照 2020 年版《中国药典》（四部）通则“9012” 对
[12]
分别与低、中、高质量浓度质控血浆样品对应，各质量浓
方法的专属性、线性关系、定量下限、精密度、准确度、稳
度平行 5 份，按“2.1”项下检测条件进样分析，记录峰面
定性、回收率、基质效应进行验证。
积（B）。按下式计算提取回收率：提取回收率＝A/B×
2.4.1 专属性考察 取 6 个不同来源的空白血浆 200
100%。结果显示，多黏菌素 B1、B2 的平均提取回收率
μL，加入0.2%甲酸溶液（不含内标）20 μL，按“2.3”项下
分别为 103.04%～111.45%、111.73%～117.44%，RSD 均
“加入 5% 三氯乙酸溶液 150 μL……取上清液”操作，再
不高于10.45%（n＝5）。结果见表2。
按“2.1”项下检测条件进样分析，记录色谱图（图 2A）。 2.4.5 基质效应 分别取不同来源的空白血浆200 μL，
取“2.2.3”项下系列标准曲线血浆样品200 μL（多黏菌素 按“2.3”项下方法处理（不加内标）后，取上清液作为空白
B1、B2 质量浓度分别为 200、50 ng/mL），按“2.3”项下方 基质，加入一定质量浓度的多黏菌素B1、B2对照品溶液
法处理后，再按“2.1”项下检测条件进样分析，记录色谱 和内标工作液，使最终质量浓度分别与低、高质量浓度
图（图 2B）。取患者给药前后的血浆样品，分别按“2.3” 质控血浆样品对应各质量浓度平行5份，按“2.1”项下检
项下方法处理后，再按“2.1”项下检测条件进样分析，记 测条件进样分析，记录峰面积（C）。另按“2.2.3”项下方
录色谱图（图2C、图2D）。结果显示，多黏菌素B1、B2和 法用0.2%甲酸溶液替代空白血浆制备与上述质量浓度
内标的保留时间均约为2.7 min，不同来源的空白血浆在 对应的多黏菌素 B1、B2 对照品溶液和内标工作液，按
待测成分保留时间附近均无干扰峰出现，表明在上述检 “2.1”项下检测条件进样分析，记录峰面积（D）。按下式
测条件下，空白血浆中的内源性物质不干扰多黏菌素 计算多黏菌素B1、B2和内标的基质效应因子：基质效应
B1、B2 和内标的测定，方法专属性良好，符合生物样品 因子＝C/D×100%。以多黏菌素 B1、B2 与内标基质效
[12]
定量分析要求 。 应因子的比值作为内标归一化基质效应因子。结果显
2.4.2 线性关系和定量下限考察 取“2.2.3”项下系列 示，多黏菌素B1、B2内标归一化基质效应因子的RSD均
标准曲线血浆样品，按“2.3”项下方法处理后，再按“2.1” 不高于7.42%（n＝5）。结果见表2。
· 706 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 6 中国药房 2023年第34卷第6期
