Page 57 - 《中国药房》2023年6期
P. 57

表2 37个变量与MIC的Pearson相关性评价结果
            40
            36                                                自变量    r    P   自变量    r    P   自变量    r    P
            32                                       HQD-N
            28                                                X 1  －0.978 a  0.022  X 14  －0.988 a  0.012  X 27  -0.997 b  0.003
            24                                                     －0.952 a  0.048  －0.992 b  0.008  －0.965 a  0.035
           U/mV  20                                  HQD-S    X 2      a       X 15   a        X 28
            16                                                X 3  －0.955  0.045  X 16  －0.987  0.013  X 29  －0.885  0.115
            12                                                X 4  －0.986 a  0.014  X 17  －0.994 b  0.006  X 30  －0.900  0.100
            8                                        HQD-P             b              b
                                                              X 5  －0.992  0.008  X 18  －0.995  0.005  X 31  －0.904  0.096
            4
            0                                        HQD      X 6  －0.989 a  0.011  X 19  －0.992 b  0.008  X 32  －0.997 b  0.003
              0  4  8 12  16  20  24  28  32  36  40  44  48  52  56  60  64  68  72  76  80  X 7  －0.989 a  0.011  X 20  －0.996 b  0.004  X 33  －0.951 a  0.049
                                t/min                                                 a               a
                                                              X 8  －0.288  0.712  X 21  －0.984  0.016  X 34  －0.961  0.039
               图4 HQD及其不同相态HQD的HPLC图                          X 9  －0.811  0.189  X 22  －0.986 a  0.014  X 35  －0.874  0.126
                                                                   －0.810  0.190   －0.805  0.195   －0.821  0.179
                                                              X 10             X 23            X 36
          刮取菌株的孢子和菌丝，并转移至无菌离心管中，静置                                     b
                                                              X 11  －0.991  0.009  X 24  －0.801  0.199  X 37  －0.885  0.115
          20 min；将上层悬液移至另一无菌离心管中，使用细胞计                        X 12  －0.265  0.735  X 25  －0.989 a  0.011
                                                    4
          数 器 调 整 菌 悬 液 的 浓 度 ，使 终 浓 度 为 1×10 ～5×             X 13  －0.999 b  0.001  X 26  －0.991 b  0.009
                                                                a：在0.05水平（双侧）显著相关；b：在0.01水平（双侧）显著相关
            4
          10 CFU/mL（CFU表示菌落形成单位），备用。另取96孔
                                                             确认了 HQD-P 的平均粒径为 4.670～91.522 μm。透析
          板 12 块（规 格 12×8，横 向 标 记 1～12 孔 ，纵 向 标 记
                                                             是为了分离汤剂中的 HQD-S 和 HQD-N，即分离由分子
          xm109～xm115），1～10 孔依次加入质量浓度分别为
                                                             或离子组成的相态，若透析时间过短，难以除去全部的
          100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195
                             [5]
          mg/mL（以浸膏量计） 的 HQD 及其不同相态 HQD 各                    游离成分；若透析时间过长，则会导致纳米粒的稳定性
                                                                 [17]
          100 μL 和须癣毛癣菌菌悬液 100 μL；11 孔加入 RPMI                降低 。本课题组前期以黄芩苷的释放速率为指标，对
          1640 培养基 200 μL，作为阴性对照；12 孔加入 RPMI                 不同透析时间（15、30、45、60、90 min）进行了考察，结果
          1640 培养基 100 μL 和须癣毛癣菌菌悬液 100 μL，作为                显示，随着透析时间的延长，黄芩苷的释放速率先升高
          阳性对照。将 96 孔板置于生化培养箱中，于 28 ℃下培                      后降低，且以 60 min 为转折点，因此笔者推测 60 min 前
          养3～5 d，观察各孔真菌的生长情况，并与阳性、阴性对                        主要是释放游离的黄芩苷，60 min后则是释放部分纳米
          照比较，以观察到无真菌生长的 MIC 为终点，每株菌种                        粒中的黄芩苷；随后，本课题组又以透析袋中纳米粒的
          平行 3 次。结果显示，HQD、HQD-P、HQD-S、HQD-N 的                粒径为指标，对不同透析次数（60 min 透析 1 次，或 30
          MIC 分别为 5.85、7.37、12.89、4.64 mg/mL。可见，在同           min 透析 2 次，或 15 min 透析 4 次）进行了考察，结果显
          等给药剂量下，抗皮肤癣菌活性由高到低依次为 HQD-                         示，透析次数对纳米粒的粒径影响较大，60 min透析1次
          N＞HQD＞HQD-P＞HQD-S。                                 后透析袋中样品的粒径约为750 nm，30 min透析2次或
          2.4.3 Pearson相关性分析 以37个共有峰峰面积为自                    15 min透析4次后样品的粒径约为120 nm，为减少透析-
          变量（记为 X1、X2、X3……X37 ），采用 SPSS 21.0 软件对             离心过程中样品的损失并获得理想的粒径，本研究选择
          HQD、HQD-P、HQD-S、HQD-N 的 37 个变量与各自 MIC              了30 min透析2次。形态观察结果显示，HQD-S冻干粉
         （因变量）进行 Pearson 相关性分析。结果显示，37 个变                    呈均匀的片状，表面未见颗粒；HQD-N冻干粉可观察到
          量中，有35个变量与MIC的相关系数绝对值（|r|）＞0.8，                    球形纳米粒，表明采用该方法能较好地分离 HQD 的不
          其中 25 个变量与 MIC 呈显著负相关（|r|＞0.95 且 P＜                同相态。
          0.05），这 25 个变量包括已指认的芍药苷、芹糖甘草苷、                         抗皮肤癣菌活性评价及 Pearson 相关分析结果显
          黄芩苷等 10 个成分，提示这些成分可能是 HQD 抗皮肤                      示，在相同的质量浓度下，HQD-N的抗皮肤癣菌作用最
          癣菌的重要活性成分。结果见表2。                                   强，其次依次为 HQD、HQD-P、HQD-S，表明 HQD-N 为
          3 讨论                                               该方的活性相态；37 个共有峰中有 25 个峰与 MIC 呈显
                                [12]
              本研究参考相关文献 建立了 HQD 的 HPLC 指纹                    著负相关，这25个峰包括了已指认的芍药苷、芹糖甘草
          图谱，方法学考察结果显示，该方法精密度、重复性、稳                          苷、黄芩苷等10个成分峰，表明HQD的抗皮肤癣菌作用
          定性均较好。相似度评价结果表明，不同批次的 HQD                          强弱与这些成分含量高低显著相关，即含量越高，抗真
          化学成分组成一致性较好，质量差异较小。通过与混合                           菌作用越强。
          对照品比对，指认了芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、                              综上所述，10 批 HQD 的 HPLC 指纹图谱的相似度
          黄芩苷、千层纸素A苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸、汉黄                         较高，化学成分组成一致性较好；HQD-N为HQD的活性
          芩素、千层纸素A共10个成分。                                    相态，其中芍药苷、芹糖甘草苷、黄芩苷等10个成分可能
              本研究采用高速离心分离得到HQD-P，以不产生肉                       是 HQD 抗皮肤癣菌的有效成分，且其抗皮肤癣菌作用
          眼可见沉淀为终点判断标准，经过粒径分析和形态观察                           强弱与上述成分含量及物理相态相关。


          中国药房  2023年第34卷第6期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 6    · 691 ·
   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62