Page 44 - 《中国药房》2023年5期
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购自北京维百奥生物科技有限公司；ECL 发光试剂盒、                          胞+三七姜醇提物大鼠组含药血清（4% 或 15%），孵育 2
          辣根过氧化物酶标记的山羊抗免疫球蛋白G二抗（批号                            h，然后加入LPS培养24 h]。
          分别为sc-2048、ZB2301）购自北京中杉金桥生物技术有                     2.5 细胞活力的检测
          限公司；其余试剂为实验室常用规格。                                       采 用 CCK-8 法 进 行 检 测 。 取 对 数 生 长 期 的
          2 方法                                                RAW264.7细胞，按“2.4”项下方法分组、造模、给药与培
          2.1 三七姜醇提物的制备                                       养，每组设 3 个复孔。培养结束后，每孔加入 CCK-8 溶
              取三七姜药材适量置于烘箱内烘干后粉碎成粗粉，                          液10 μL，混匀后孵育2 h，采用酶标仪于450 nm波长处
          加入 8 倍量的 80% 乙醇溶液加热回流提取 3 次，每次 2                    测定各孔吸光度（absorbance，A）值，并计算细胞存活率
          h；过滤，合并滤液，60 ℃减压回收乙醇至药液无醇味，水                       （细胞存活率＝A 给药孔/A 对照孔×100%）。
          浴加热浓缩得三七姜醇提物浸膏，备用。取浸膏0.15 g，                        2.6 细胞中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6含量的检测
          精密称定，加入 0.1% 的二甲基亚砜超声（频率 50 kHz，                        采 用 ELISA 法 进 行 检 测 。 取 对 数 生 长 期 的
          功率 250 W）溶解，再用 DMEM 不完全培养基稀释至 3                     RAW264.7细胞，按“2.4”项下方法分组、造模、给药与培
          mg/mL，过无菌滤膜，再用完全培养基稀释至所需浓度，                         养，每组设3个复孔。培养结束后，收集细胞培养液，在
          现用现配。                                               室温条件下 1 200 r/min 离心 10 min，取上清液，根据相
          2.2 三七姜醇提物大鼠含药血清的制备                                 应试剂盒说明书方法进行操作，测定各孔 A 值，并计算
              取12只大鼠随机分为空白组和三七姜醇提物组，每                         NO、TNF-α、IL-1β、IL-6含量。
          组各6只。三七姜醇提物组大鼠按75.35 g/kg（按生药量                      2.7 细胞中TLR4、NF-κB mRNA表达水平的检测
          计算）灌胃（剂量相当于成人临床等效剂量的50倍），空                              采 用 RT-PCR 法 进 行 检 测 。 取 对 数 生 长 期 的
          白组大鼠灌胃等体积纯净水，每天灌胃2次，连续给药3                           RAW264.7细胞，按“2.4”项下方法分组、造模、给药与培
          d。第3天灌胃后0.5、1、1.5 h（给药前禁食不禁水12 h），                  养，每组设3个复孔。培养结束后，采用Trizol试剂提取
          末次给药1 h后用戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，室                           细胞总 RNA，利用逆转录试剂盒制备 cDNA，以 cDNA
          温静置 2 h 后，以 3 000 r/min 离心 10 min；无菌分离血             为 模 板 进 行 PCR。 PCR 反 应 体 系（共 20  μL）为 Go‐
          清，将3个时间点的血清等比例混合，以0.22 μm微孔滤                        Taq qPCR  Master  Mix  10  μL，上 下 游 引 物 各 0.5  μL，
                                                                 ®
          膜过滤除菌，56 ℃灭活30 min，分装，置于－80 ℃保存。                    cDNA 1.5 μL，Nuclease-Free Water 7.5 μL。反应条件为
          使用时，以DMEM不完全培养基稀释至所需浓度。                             95 ℃热变性 120 s，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火延伸 30 s，
          2.3 细胞培养                                            循环40次。以GAPDH为内参，采用2             －ΔΔCt 法分析目的基
              将 RAW264.7 细胞采用完全培养基[10% 胎牛血清
                                                              因的表达水平。PCR引物序列及扩增产物长度见表1。
         （FBS）+1% 双抗+89% DMEM 不完全培养基]在 37℃含
                                                                      表1 PCR引物序列及扩增产物长度
          5% CO2的培养箱中培养。
                                                              基因           引物序列（5′→3′）              扩增产物长度/bp
          2.4 细胞分组、造模与培养                                      TLR4         上游：TCTGGGGAGGCACATCTTCT     110
              将 RAW264.7 细胞按 5 000 个/孔接种于 96 孔板中，                          下游：AGGTCCAAGTTGCCGTTTCT     110
                                                              NF-κB        上游：AGAAAATGGCGGAGTTTGGG     135
          当其融合度达 80% 时，分为正常对照组（DMEM 培养                                     下游：AGCTGAACAAACACGGAAGC     135
          基+RAW264.7 细胞，不作任何处理，培养 24 h），LPS 组                 GAPDH        上游：GGTTGTCTCCTGCGACTTCA     183
          [DMEM 培 养 基 +RAW264.7 细 胞 +LPS（终 浓 度 为 1                         下游：TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC    183
          μg/mL，下同），培养 24 h]，三七姜醇提物高、中、低剂量                    2.8 细胞中NOS、COX-2蛋白表达水平的检测
          组[DMEM 培养基+RAW264.7 细胞+高、中、低剂量三七                        采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的
          姜醇提物（终浓度分别为 50、25、12.5 μg/mL，浓度设置                   RAW264.7细胞，按“2.4”项下方法分组、造模、给药与培
          参考预实验结果），孵育 2 h，然后加入 LPS，培养 24 h]，                  养，每组设 3 个复孔。培养结束后，收集细胞，加入 300
          4% 或 15% 空白血清组[DMEM 培养基+RAW264.7 细                  μL RIPA 裂解液，充分混匀，裂解 2 h；再以 12 000 r/min
          胞+空白对照组大鼠血清（4% 或 15%，浓度设置参考预                        离心10 min，取上清液。采用BCA试剂盒测定上清液中
          实验结果），培养 24 h]，4% 或 15% 空白血清+LPS 组                  的蛋白浓度，然后将蛋白进行变性处理，经十二烷基硫
          [DMEM 培养基+RAW264.7 细胞+空白对照组大鼠血清                     酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后将蛋白转至PVDF膜上；以
         （4% 或 15%），孵育 2 h，然后加入 LPS 培养 24 h]，4% 或             5%脱脂牛奶封闭1 h，加入GAPDH（稀释度为1∶2 000）、
          15% 含药血清组[DMEM 培养基+RAW264.7 细胞+三七                   COX-2（稀释度为 1∶800）、NOS（稀释度为 1∶800）一抗，
          姜醇提物组大鼠含药血清（4% 或 15%），培养 24 h]，4%                   4 ℃孵育过夜；以PBST洗膜2次，加入相应二抗（稀释度
          或 15% 含药血清+LPS 组[DMEM 培养基+RAW264.7 细                为 1∶3 000）室温下孵育 1～2 h；以 PBST 洗膜 3 次，加


          · 550 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 5                               中国药房  2023年第34卷第5期
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