Page 33 - 《中国药房》2023年5期
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2 方法                                               治疗结束后，结扎大鼠股静脉，分层缝合肌肉和皮肤，放
          2.1 网络药理学分析                                        回动物房单笼观察。本实验剂量依据均参考前期预实
          2.1.1  脓 毒 症 的 靶 点 筛 选  通 过 PubChem 数 据 库          验结果。
         （http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索地榆皂苷Ⅰ的英         2.2.2 大鼠动脉血气及血清炎症因子水平检测 分别
          文关键词“ziyuglycoside Ⅰ”，得到其3D结构，导入Swiss-             采用全自动血气分析仪和ELISA试剂盒检测。Sep组大
          TargetPrediction 数 据 库（http：//www. swisstargetpredic‐  鼠于术后 12 h，Sham 组、CT 组和 ZgⅠ组大鼠于治疗结
          tion.ch/） ，得到相关的预测靶点。                              束后 3 h，将大鼠麻醉固定，取大鼠腹主动脉血 1 mL，检
                 [10]
          2.1.2 脓毒症-地榆皂苷Ⅰ共同靶点筛选 通过 Gene                      测动脉氢离子浓度指数（hydrogen ion concentration，简称
                                             [11]
          Cards 数据库（https：//www.genecards.org/） 搜索关键词        pH 值）、动脉血氧分压（partial arterial oxygen pressure，
         “脓毒症”，得到其相关靶点。通过Venny在线绘图工具                         PO2 ）、二氧化碳分压（partial pressure of carbon dioxide，
         （https：//bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index. html）绘  PCO2 ）水平。另取大鼠股静脉血2 mL，室温下静置2 h，
          制脓毒症与地榆皂苷Ⅰ的靶点交集图。                                  1 000×g离心10 min，取上层血清，检测大鼠血清炎症因子
          2.1.3 脓毒症-地榆皂苷Ⅰ靶点的 PPI 网络构建 通过                     TNF-α、IL-6水平。
          将Venny图取交集得到的靶点数据输入到String数据库                      2.2.3 肺湿/干质量比计算 取材时间同“2.2.2”项下，将
         （https：//string-db.org/） ，利用 Cytoscape 3.7.1 软件绘制   大鼠麻醉固定并处死，打开胸腔，取左肺上叶，用滤纸吸
                            [12]
                   [13]
          PPI网络图 。                                           干肺组织表面血液，并称质量，而后放置在锡箔纸上。
          2.1.4 基因本体功能富集分析和京都基因与基因组百                         50 ℃烤箱烘干72 h后再次称质量，计算湿/干质量比，作
          科全书通路富集分析 通过David数据库（https：//david.                为评价肺水肿情况的指标。
                    [14]
          ncifcrf.gov/） 对脓毒症与地榆皂苷Ⅰ靶点交集进行基                    2.2.4 肺组织病理形态观察 采用苏木素-伊红（HE）染
          因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与                  色。取材时间同“2.2.2”项下，在大鼠吸气末夹闭并结扎
          基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and ge‐        气管，使肺充盈，打开胸腔，经心脏灌注等渗生理盐水直
          nomes，KEGG）通路富集分析，以P≤0.05进行功能条目                    至肺组织几乎不见血色，后用 4% 多聚甲醛继续灌注。
          和信号通路筛选。
                                                             取下肺组织，用 4% 多聚甲醛固定后，石蜡包埋并切片。
          2.2 实验验证
                                                             将肺组织石蜡切片置于 60 ℃烤箱，于二甲苯和梯度酒
          2.2.1 分组、造模与给药 将192只SD大鼠按随机数字
                                                             精中脱蜡并水化。苏木素染细胞核，伊红染细胞质，脱
          表法分为4组：假手术组（Sham组）、脓毒症组（Sep组）、
                                                             水封片后使用微循环显微镜观察各组大鼠肺组织病理
          常规治疗组（CT 组）和地榆皂苷Ⅰ治疗组（ZgⅠ组），每
                                                             形态并拍照。
          组48只。本文采用CLP术制备SD大鼠脓毒症模型，以
                                                             2.2.5 肺血管通透性观察 采用伊文思蓝染色。取材
          30 mg/kg戊巴比妥钠经腹腔进行麻醉，大鼠对针刺感无
                                                             时间同“2.2.2”项下，经颈静脉插管按60 mg/kg剂量注射
          反应后，将其置于绑鼠板，沿腹中线剪开皮肤约 2 cm。
                                                             伊文思蓝，注射后 30 min 沿腹白线打开腹腔，结扎下腔
          Sham组只进行探查操作，不进行盲肠结扎和穿孔。Sep
                                                             静脉，剪开腹主动脉，经颈静脉缓慢灌注 50 mL 生理盐
          组、CT组、ZgⅠ组用无菌镊探查盲肠后用无菌手术缝线
                                                             水，此时肺组织基本不见血色，取完整肺组织并处死大
            #
         （4）于回盲瓣下方近盲肠端1/4处结扎盲肠，使用20G无
                                                             鼠。用冷 PBS 漂洗表面血液，滤纸吸干组织表面水分，
          菌针头于盲肠远端近结扎处穿孔，此时针头从进针处贯
                                                             立即肉眼观察肺血管通透性并拍照。
          通盲肠，挤出肠道内容物约 0.2 mL，按解剖结构将结扎
                                                        #
          盲肠与肠道内容物一同还纳腹腔并用无菌手术缝线（1）                          2.2.6 肺静脉 ZO-1、VE-cadherin 蛋白表达的检测 采
          逐层缝合切口。术后每组按 25 mL/kg 剂量腹腔注射无                      用 Western blot 法检测。取材时间同“2.2.2”项下，取肺
          菌生理盐水。CLP术后 12 h 插管监测大鼠平均动脉压，                      静脉组织，提取组织总蛋白。经电泳分离蛋白，转膜，脱
          当平均动脉压下降 30% 或以上，认为造模成功 。CT                        脂牛奶封闭，孵育 ZO-1 一抗、VE-cadherin 一抗、β-actin
                                                   [15]
          组大鼠在 CLP 术后 12 h 经股静脉输注 35 mL/kg 林格氏               一抗（稀释度分别为 1∶1 000、1∶2 000、1∶6 000），4 ℃冰
          液，同时予以 1.75 mg/kg 血管活性药物多巴胺及 100                   箱过夜。次日 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min，室温孵育山
          mg/kg 抗生素头孢呋辛钠。ZgⅠ组大鼠在 CLP 术前 1 h                  羊抗兔二抗（稀释度1∶20 000），采用双色红外线激光成
          经鼠尾静脉注射 10 mg/kg 地榆皂苷Ⅰ[实验前，将 100                   像系统曝片。采用 Image J 软件分析蛋白条带灰度值，
          mg地榆皂苷Ⅰ溶于1 mL 二甲基亚砜（DMSO）得到100                     以目的条带灰度值与 β-actin 条带灰度值的比值表示目
          mg/mL 地榆皂苷Ⅰ溶液]，术后 12 h 在常规治疗的基础                    的蛋白的表达水平。
          上股静脉输注10 mg/kg地榆皂苷Ⅰ（取地榆皂苷Ⅰ溶液                       2.2.7 大鼠 72 h 存活情况 每组按随机数表法随机选
          溶于 500 μL 无菌生理盐水后经尾静脉注射给药，保证                       取16只SD大鼠，CLP术后12 h造模成功开始，记录大鼠
          DMSO最终浓度低于10%，减轻DMSO对动物的毒性）。                       的72 h存活时间，并计算72 h存活率。


          中国药房  2023年第34卷第5期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 5    · 539 ·
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