Page 22 - 《中国药房》2023年5期

夜，次日用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗；加入异硫氰酸荧光 80 40
素标记的羊抗兔 IgG 二抗（稀释度为 1∶100），室温孵育 60 a b 30 b c c
15 min；加入DAPI染液染色，PBS冲洗，防荧光猝灭剂封 总活动距离/m 40 直立次数 20 a
片。每张切片随机选取 5 个高倍（×400）视野，使用 20 10
Image J软件对免疫荧光图片进行处理并计算荧光强度， 0 0
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
荧光强度＝该区域荧光强度总和/该区域面积。绿色荧 A.总活动距离 B.直立次数
光代表目的蛋白的表达，蓝色荧光代表DAPI。 Ⅰ：空白组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：地西泮组；Ⅳ：酒五味子组；Ⅴ：生五味
子组；a：与空白组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01；c：与模型
2.9 小鼠脑 SCN 组织中 Bmal11、Clock、Per22 mRNA 表
组比较，P＜0.05
达的检测 图1 各组小鼠自主活动相关指标检测结果（x±s，
采用实时荧光定量PCR检测。取“2.6”项下－80 ℃ n＝10）
冻存的小鼠脑 SCN 组织，先用 Trizol 提取总 RNA，并检
3.3 生、酒五味子对小鼠睡眠时相的影响
测总 RNA 浓度及纯度。取总 RNA 适量，反转录成
与空白组比较，模型组小鼠 wake 所占时间比显著
cDNA 后进行 PCR 扩增。反应条件为：94 ℃，30 s，然后
上 升（P＜0.05），NREM、REM 所 占 时 间 比 显 著 下 降
分三步反应，即 94 ℃、5 s，55 ℃、15 s，72 ℃、10 s，进行
（P＜0.01 或 P＜0.05）。与模型组比较，地西泮组、酒五
42 个循环，用以检测 Per2、Bmal1、Clock mRNA 的表达。
味子组小鼠 wake 所占时间比显著下降（P＜0.05），地西
采用2 －ΔΔCt 法计算目的基因的相对表达水平，并以GAPDH
泮组、酒五味子组、生五味子组小鼠 NREM 所占时间比
为参照基因，各基因引物序列及产物长度见表2。
显著升高（P＜0.01或P＜0.05）。结果见图2。
表2 引物序列及产物长度
80 20 50
基因 引物序列（5′→3′） 产物长度/bp b c 40 d d
Bmal1 上游引物：GGGGAAATACGGGTGAAATCTA 275 60 c 15 b c
下游引物：CTGAACCATCGACTTCGTAGCG Wake所占时间比/% 40 REM所占时间比/% 10 NREM所占时间比/% 30 a
Per2 上游引物：CAAGGCCGAGAGTGTGGTGT 190 20 5 20
下游引物：GGTGAGGCCCAACTTCTGAA 10
Clock 上游引物：AGAAGTTAGGGCTGAAAGACGG 262 0 0 0
下游引物：ATGCTGTCTGGGAGGAGTGCTA Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
A. wake B. REM C. NREM
GAPDH 上游引物：CCTCGTCCCGTAGACAAAATG 133 Ⅰ：空白组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：地西泮组；Ⅳ：酒五味子组；Ⅴ：生五味
下游引物：TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT
子组；a：与空白组比较，P＜0.01；b：与空白比较，P＜0.05；c：与模型组
2.10 统计学方法 比较，P＜0.05；d：与模型组比较，P＜0.01
所有数据均采用统计软件GraphPad Prism 6.0处理， 图2 各组小鼠睡眠时相的检测结果（x±s，n＝10）
计量资料以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析， 3.4 生、酒五味子对小鼠脑 SCN 组织中神经递质含量
进一步两两比较使用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。 的影响
3 结果 与空白组比较，模型组小鼠脑 SCN 组织中 5-HT 含
3.1 生、酒五味子对小鼠一般状态的影响 量显著降低（P＜0.05），NE、DA、CORT 含量均显著升高
空白组小鼠精神状态良好、动作反应灵敏，比较温 （P＜0.01）。与模型组比较，地西泮组和酒五味子小鼠
和，饮食和饮水正常，毛发色泽光亮，昼夜节律正常。与 脑 SCN 组织中 GABA、5-HT 含量均显著升高（P＜0.01
空白组比较，模型组小鼠精神状态相对萎靡，对外界刺 或 P＜0.05），酒五味子组小鼠脑 SCN 组织中 DA、CORT
激敏感，容易激怒和受惊，饮食量和饮水量增加，体质量 含量显著降低（P＜0.01），生五味子组小鼠脑 SCN 组织
降低，毛发粗糙无光泽，昼夜节律出现不规律现象。与 中CORT含量显著降低（P＜0.01）；地西泮组小鼠脑SCN
模型组比较，生五味子组、酒五味子组和地西泮组小鼠
组织中 DA、CORT、NE 含量均显著降低（P＜0.01）。结
精神状态较好，饮食量和饮水量降低（接近空白组），毛
果见图3。
发色泽有少量不光泽，昼夜节律相对得到改善。 3.5 生、酒五味子对小鼠脑 SCN 组织中 IL-1β、TNF-α
3.2 生、酒五味子对小鼠自主活动的影响 表达的影响
与空白组比较，模型组小鼠总活动距离、直立次数 与空白组比较，模型组小鼠脑 SCN 组织中 IL-1β、
均显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，地西泮组小鼠 TNF-α的绿色荧光表达较强，荧光强度均显著升高（P＜
总活动距离、直立次数均显著增加（P＜0.01）；酒五味子 0.01）。与模型组比较，地西泮组、酒五味子组小鼠给药
组、生五味子组小鼠的直立次数均显著增加（P＜0.05）。 后绿色荧光表达减弱，荧光强度均显著降低（P＜0.05或
结果见图1。 P＜0.01）。结果见图4～图6。

· 528 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 5 中国药房 2023年第34卷第5期