Page 21 - 《中国药房》2023年5期
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B25300、S10067、S38336、B21001、S20192，纯度分别为           2.4 小鼠自主活动测试
          99％、99％、98％、98％、98％、98％、98％）均购自上海源                     灌胃给药第35 d后进行旷场实验，将小鼠放置于旷
          叶生物科技有限公司；牙科水泥及其自凝水溶剂均购自                           场实验检测箱的中心区域进行测试，测试时间4 min，前
          上海玉研科学仪器有限公司；抗荧光淬灭封片液、4′，6-                        1 min 为适应期，记录 3 min 内小鼠总活动距离及直立
          二 脒 基 -2- 苯 基 吲 哚（DAPI）染 色 液（批 号 分 别 为             次数。
          16D26C36、16I29C76）均购自于武汉博士德生物工程有                   2.5 小鼠睡眠时相监测
          限公司。                                                   将小鼠麻醉，用脑立体定位仪固定，充分暴露颅骨，
          1.3 主要仪器                                           钻孔，将与记录电极连接的不锈钢螺丝钉植入颅骨相应
              XR-XZ301S 型 SMART 3.0 动物行为学视频分析系               位置及背部颈肌。在12 h/12 h的明暗光照条件下，采用
          统购自上海欣软信息科技有限公司；63001 型旷场实验                        小鼠脑电、肌电记录监测系统录小鼠的脑电、肌电信号。
          检测箱购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；ABI                            记录结束后，根据统一设定的标准扫描记录的信号，自
                  ®
          GeneAmp  9700型聚合酶链式反应（PCR）扩增仪购自瑞                   动判别出觉醒期（wake）、非快速眼动睡眠期（non-rapid
          士 Roche 公司；TCS SP8 型激光共聚焦显微系统购自德                   eye  movement，NREM）和 快 速 眼 动 睡 眠 期（rapid  eye
          国Leica公司；68003型脑立体定位仪购自深圳市瑞沃德                      movement，REM），计算出各自所占时间比。
          生命科技有限公司；UltiMate 3000型超高效液相色谱仪                    2.6 实验取材
          购自日本岛津公司；Triple TOF 5600型串联飞行时间质                       各组小鼠完成睡眠时相监测后，用 0.5% 戊巴比妥
          谱仪购自美国Sciex公司；小鼠脑电、肌电记录监测系统                        钠经腹腔注射麻醉小鼠，断头取脑，冰上分离小鼠脑视
          购自美国Pinnacle公司。                                    交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）组织，一部分置
          2 方法                                               于液氮速冻，并于24 h内移至－80 ℃冰箱保存备用，另
          2.1 生、酒五味子提取物的制备                                   一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定备用。
              生五味子提取物的制备：将五味子干燥成熟果实用                         2.7 小鼠脑SCN组织中神经递质含量检测
          8倍量的水每次提取2 h，共提取3次，在真空中浓缩成浸                        2.7.1 脑SCN组织样本的制备 称取“2.6”项下小鼠脑
                                                             SCN组织，按质量体积比1∶2加入预冷生理盐水制成脑
          膏，在冷冻干燥机中干燥浸膏，在4 ℃冰箱中储存备用。
          酒五味子按照如下传统工艺进行制备：取五味子干燥成                           匀浆后，取匀浆液 100 µL，加入 360 µL 乙腈和 20 µL
                                                             ACE（内标）。在 4 ℃以 15 000 r/min 离心 15 min，吸取
          熟果实，加黄酒（每100 kg生品五味子加黄酒20 kg）拌匀，
                                                             上清液 100 µL 于进样小瓶中，放入冰箱保存，用于超高
          稍闷，置蒸器内（密封）蒸至上大汽，当五味子表面显示
                                                             效液相色谱-串联质谱分析。
          紫黑色后，放入干燥箱中 60 ℃彻底干燥后获得酒五味
                                                             2.7.2 色谱条件 色谱条件为 Welch C18 柱（1.7 mm×
          子；将制得的酒蒸五味子用 8 倍量的水每次提取 2 h，共
                                                             100 mm，1.7 µm），流动相为 0.01%甲酸水溶液（A）-乙腈
          提取3次，在真空中浓缩成浸膏，在冷冻干燥机中干燥浸
          膏，在4 ℃冰箱中储存备用。                                    （B），梯度洗脱（0.001～1 min，2%B；1～4 min，2%B→
          2.2 分组、造模与给药                                       30%B；4～10 min，30%B→90%B；10～10.1 min，90%B→
              50只小鼠随机分为空白组、模型组、地西泮组（阳性                       100%B；10.1～13 min，100%B；13～13.1 min，100%B→
                                                             5%B）。进样量为2 μL，柱温为40 ℃。
          对照）、生五味子组、酒五味子组，每组10只。除空白组
                                                             2.7.3 质谱条件 以正离子多反应检测模式进行扫描。
          外，其余 4 组小鼠按 0.47 mg/kg 腹腔注射甲状腺素溶液
                                                             各神经递质及内标质谱参数信息见表1。
          进行造模。当小鼠出现活动次数增加、易激惹、昼夜节
                                                              表1 小鼠脑SCN组织中各神经递质及内标质谱参数
          律缺失、白天与夜晚活动不间断等行为表示造模成
                                                              指标          母离子m/z   子离子m/z   去簇电压/V   碰撞能量/eV
            [11]
          功 。每天造模结束后，生五味子组、酒五味子组小鼠
                                                              5-HT        177.100   160.100   70.00    17.00
                                              [12]
          分别灌胃生、酒五味子溶液各0.85 g/（kg·d） ，地西泮组                    DA          154.100   137.100   60.00    14.00
          小鼠灌胃地西泮1 mg/（kg·d） ，空白组和模型组小鼠给                      CORT        347.100   329.400   85.00    30.00
                                  [13]
                                                              GABA        104.100   87.100    45.00    13.00
          予等体积的生理盐水，所有小鼠每日灌胃 1 次，共持续                          NE          777.700   731.700   50.00    35.00
          35 d。                                               ACE（内标）     152.000   123.000   31.00    14.00
          2.3 小鼠一般状态观察                                       2.8 小鼠脑SCN组织中IL-1β、TNF-α表达检测
              每日观察小鼠外观（毛发色泽、光亮度、稀疏程度）、                           取“2.6”项下 4% 多聚甲醛溶液中固定的小鼠脑
          神态（精神状态、意识状态、反应灵敏度）、活动、食欲等                         SCN组织，依次进行石蜡包埋、切片、脱水，加入IL-1β一
          一般状况。                                              抗、TNF-α 一抗（稀释度分别为 1∶500、1∶100），孵育过


          中国药房  2023年第34卷第5期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 5    · 527 ·
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