Page 27 - 《中国药房》2023年5期
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记的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗购自美国Affinity公司                       片后，于显微镜下观察。每张切片在显微镜下随机选取
         （批号S0001）。                                          5 个高倍视野，以棕黄色为阳性染色，采用 Image-Pro
          1.3 动物                                             Plus 6.0软件分析并计算单位测量区域面积内的光密度
              本研究所用动物为SPF级雄性SD大鼠，共24只，体                      值，用于评价阳性表达水平。
          质量为（200±20） g，2 月龄，由南京凯斯佳生物科技有                     2.5 大鼠肝脏组织中ERs相关蛋白表达水平的检测
          限公司提供，动物生产合格证号为 SCXK（苏）2020-                           采用Western blot法进行检测。取大鼠肝脏组织60
          0001。 所 有 大 鼠 均 饲 养 于 光/暗 各 12  h、室 温（25±          mg，加入适量 RIPA 裂解液，同时各加入 1% 的蛋白酶抑
          2） ℃、相对湿度（60±5）%的SPF级实验动物中心，自由                     制剂与磷酸酶抑制剂，充分匀浆，冰浴裂解 30 min。于
          摄食、饮水。本研究经南京中医药大学附属中西医结合                           4 ℃下以 12 000 r/min 离心 30 min，取上清液，采用 BCA
          医院实验动物伦理委员会批准，批准编号为 AEWC-                          法测定蛋白浓度。蛋白经变性后，取 30 μg 进行十二烷
          20200702-119。                                      基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜； 用含 5% 脱脂奶
          2 方法                                               粉 的 TBST 溶 液 封 闭 1.5  h，分 别 加 入 Grp78、CHOP、
          2.1 造模、分组与给药                                       ATF6、PERK、p-PERK、IRE1α 一抗（稀释度为 1∶1 000）

              大鼠适应性喂养1周后，随机分为空白组、模型组和                        和 β-actin 抗体（稀释度为 1∶5 000），4 ℃孵育过夜；以
          告达庭低、高剂量组（25、50 mg/kg，剂量根据前期的实验                    TBST 溶液洗膜 3 次，每次 6 min，滴加辣根过氧化物酶
                  [4]
          结果设定 ，临用时以 0.5% 羧甲基纤维素钠溶解）。除                       标记的二抗（稀释度为1∶5 000），室温孵育1 h；TBST溶
          空白组外，其余各组大鼠均采用腹腔注射 DEN（50                          液洗膜3次，每次10 min，滴加ECL发光液，采用化学发
                                        [11]
          mg/kg）的方法构建大鼠肝损伤模型 ，每周注射3次，连                       光凝胶成像系统采集图像，并应用 Image J 软件分析蛋
          续 8 周。于造模第 5 周开始，大鼠灌胃相应药物或 0.5%                    白灰度值。以Grp78、CHOP、ATF6、IRE1α与内参β-actin
          羧甲基纤维素钠，连续 4 周。大鼠末次给药后空腹 8 h，                      的灰度值比值表示其表达水平；以 PERK 与 p-PERK 的
          眼眶取血，血样室温静置 30 min 后，以 3 000 r/min 离心              灰度值比值表示PERK蛋白的磷酸化水平。
          10 min，取上清液，置于－80 °C 冰箱保存备用。取血完                    2.6 统计学分析
          成后，处死各组大鼠，并剖取肝脏组织备用。                                   采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，数据以 x±s 表
          2.2 大鼠血清中肝功能指标及炎症因子水平的测定
                                                             示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采
              取各组大鼠血清，采用自动生化分析仪分析血清中
                                                             用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          肝 功 能 生 化 指 标 丙 氨 酸 转 氨 酶 （alanine  aminotrans-
                                                             3 结果
          ferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，
                                                             3.1 告达庭对模型大鼠肝功能生化指标的影响
          AST）、总蛋白（total protein，TP）和总胆红素（total bilirubin，
                                                                 与空白组相比，模型组大鼠血清中 ALT、AST、TBI
          TBI）水平；采用ELISA 试剂盒测定大鼠血清中炎症因子
                                                             水平均显著升高（P＜0.05），血清中 TP 水平显著降低
          IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。
                                                            （P＜0.05）；与模型组相比，告达庭各高剂量组大鼠血清
          2.3 大鼠肝脏组织病理学形态观察
                                                             中ALT、AST、TBI水平均显著降低（P＜0.05），TP水平均
              取大鼠肝脏组织适量，经4%多聚甲醛固定，乙醇梯
                                                             显著升高（P＜0.05）。结果见表1。
          度脱水，石蜡包埋后，制成4 μm的切片；然后经苏木素-
                                                             表1 各组大鼠血清中肝功能生化指标的检测结果（x±
          伊红（HE）染色后，在光镜下观察肝脏组织的病理学变                               s，n＝6）
          化，并拍照。                                              组别          ALT/（U/L）  AST/（U/L）  TP/（g/L）  TBI/（μmol/L）
          2.4 大鼠肝脏组织中NF-κB、Grp78蛋白表达的检测                       空白组        10.17±2.40  14.67±3.78  58.17±5.38  6.33±0.82
                                                              模型组        31.67±3.78 a  39.50±5.79 a  51.33±2.73 a  9.83±1.41 a
              采用免疫组化法进行检测。取大鼠肝脏组织适量，
                                                              告达庭低剂量组    23.83±2.41 b  29.50±4.14 b  57.33±3.67 b  8.25±0.74 b
          同“2.3”项下方法制备大鼠肝脏石蜡切片，再进行常规脱                         告达庭高剂量组    18.67±2.34 b  23.17±3.25 b  58.57±3.39 b  7.95±0.91 b
          蜡复水、抗原修复；取出切片，浸泡于 3% 过氧化氢溶液                           a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
          中，以灭活内源性过氧化物酶；室温避光孵育 10 min，                       3.2 告达庭对模型大鼠血清中炎症因子水平的影响
          滴加 10% 山羊血清封闭 30 min，滴加 Grp78 一抗（稀释                    与空白组相比，模型组大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-
          度为 1∶200）、NF-κB一抗（稀释度为1∶1 600），4 ℃孵育               1β水平均显著升高（P＜0.05）；模型组相比，告达庭高剂
          过夜。次日，于 37 ℃条件下孵育相应二抗 30 min；以                     量组大鼠血清中 IL-6、TNF-α、IL-1β 水平均显著降低
          DAB显色，苏木素复染细胞核，经乙醇脱水、中性树胶封                        （P＜0.05），告达庭低剂量组大鼠血清中 IL-6 水平显著


          中国药房  2023年第34卷第5期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 5    · 533 ·
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