Page 26 - 《中国药房》2023年4期
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μmol/L，根据预实验结果设置），每组设置 6 个复孔；同                      3 个复孔）、处理、培养。随后，收集各组细胞，用磷酸盐
                                                 o
          时设置不含细胞、不含药物的空白组。于 37  C、5%CO2                      缓冲液洗涤２次，加入 RIPA 细胞裂解液 100 μＬ，于冰
          条件下培养 24 h 后，弃去上清液，对照组和低压缺氧组                        浴中放置30 min，于4 ℃下以1 500 r/min离心15 min；取
          细胞加入完全培养基100 μL，7-HEC组细胞分别加入含                       上清液，以BCA法进行定量后，加上样缓冲液煮沸变性
          7-HEC 100、10、1、0.1、0.01 μmol/L 的完全培养基 100           10 min，取变性蛋白样品 50 μg 进行 10% 十二烷基硫酸
          μL，按“2.2”项下方法处理。培养 24 h 后，每孔加入                      钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至聚偏二氟乙烯膜上，
          CCK-8 试剂 10 μL，于 37 ℃下孵育 1 h，使用酶标仪于                 用含50 g/L脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭1 h，加入
          450 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值并按下式计算                        cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin 一抗（稀释比例均
          细胞存活率：细胞存活率＝（实验组OD值－空白组OD                           为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；用TBST缓冲液洗膜3次，加
          值）/（对照组OD值－空白组OD值）×100%。                            入二抗（稀释比例为1∶5 000），室温孵育1 h；用TBST缓
          2.4 细胞中LDH、MDA含量和SOD活性检测                            冲液洗膜3次，以凝胶成像系统成像，以目标蛋白与内参
              取生长良好且处于对数生长期的 PC12 细胞，用                        蛋白（β-actin）灰度值的比值表示目标蛋白的表达水平，
                                       6
          0.25% 胰酶消化后，按每孔 2×10 个接种于 6 孔板中。                    并记录 Bax 与 Bcl-2 表达水平的比值（Bax/Bcl-2 比值），
          将细胞分为对照组、低压缺氧组、7-HEC 组（1 μmol/L，                    实验重复3次。
          根据“2.3”项下结果设置），每组设置 6 个复孔。按“2.3”                    2.7 统计学方法
          项下方法培养 24 h，收集细胞和上清液，使用酶标仪以                             使用 GraphPad Prism 9.0 软件对数据进行统计分
          LDH 试剂盒（L-P 法）检测上清液中 LDH 含量，以 MDA                   析。每组实验至少重复3次。数据均以x±s表示，多组
          试剂盒（TBA法）检测细胞中MDA含量，以SOD试剂盒                         间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t
         （WST-8法）检测细胞中SOD活性，严格按照试剂盒说明                         检验。检验水准α＝0.05。
          书操作。                                                3 结果
          2.5 细胞凋亡和细胞周期检测                                     3.1 不同浓度7-HEC对低压缺氧细胞存活率的影响
          2.5.1 细胞凋亡 采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细                     与对照组比较，低压缺氧组细胞的存活率显著降低
          胞术检测。取生长良好且处于对数生长期的 PC12 细                         （P＜0.01）；与低压缺氧组比较，7-HEC 10、1、0.1 μmol/L
          胞，按“2.4”项下方法分组（每组设置3个复孔）、处理、培                       组细胞的存活率均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），提示
          养。随后，弃去上清液，细胞用 4 ℃预冷的磷酸盐缓冲                          在上述浓度下，7-HEC 可逆转细胞存活率的降低，故选
          液清洗 2 次，用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化 1 min，于                      择作用较明显的1 μmol/L进行后续实验。结果见图1。
          室温下以1 500 r/min离心5 min；用4 ℃预冷的磷酸盐缓                    110
          冲液清洗2次，以1 500 r/min离心5 min，弃去上清液；细                     90
                                                                                             c
          胞用1×bingding buffer 400 μL重悬，制成密度为1×10         6       70         a          b           b
          个/mL 的悬液；取上述悬液，加入 Annexin Ⅴ-FITC 试剂                  细胞存活率/％  50
          适量（每 100 μL 悬液加入 Annexin Ⅴ-FITC 试剂 5 μL），              30
          轻轻混匀，室温避光孵育 15 min；加入 PI 试剂 10 μL 和                    10
          1×binding buffer 400 μL，轻轻混匀，使用流式细胞仪检                 －10  对照组  低压缺  7-HEC 100 7-HEC 10  7-HEC 1 7-HEC 0.1 7-HEC 0.01
                                                                          氧组   μmol/L组  μmol/L组 μmol/L组 μmol/L组  μmol/L组
          测细胞凋亡率（%）。                                             a：与对照组比较，P＜0.01；b：与低压缺氧组比较，P＜0.05，c：与低
          2.5.2 细胞周期 采用流式细胞术检测。取生长良好                          压缺氧组比较，P＜0.01
                                                              图1 不同浓度 7-HEC 对低压缺氧细胞存活率的影响
          且处于对数生长期的 PC12 细胞，按“2.4”项下方法分组
                                                                  （x±s，n＝6）
         （每组设置3个复孔）、处理、培养。随后，收集各组细胞，
          用磷酸盐缓冲液清洗2次后，于－20 ℃ 75%乙醇中固定                        3.2  7-HEC 对 低 压 缺 氧 细 胞 中 LDH、MDA 含 量 和
          过夜；以 1 500 r/min 离心 5 min，收集细胞，用磷酸盐缓                SOD活性的影响
          冲液清洗 2 次后，用 RNaseA 试剂重悬并于 37 ℃下孵育                       与对照组比较，低压缺氧组细胞上清液中LDH含量
          30 min；加入PI试剂400 μL，于4 ℃下避光孵育30 min，                和细胞中MDA含量均显著升高，细胞中SOD活性显著
          使用流式细胞仪检测各周期的分布情况。                                  降低（P＜0.01）。与低压缺氧组比较，7-HEC 组细胞上
          2.6 细胞中凋亡相关蛋白表达检测                                   清液中 LDH 含量和细胞中 MDA 含量均显著降低（P＜
              采用 Western blot 方法检测。取生长良好且处于对                  0.01），细 胞 中 SOD 活 性 显 著 升 高（P＜0.01）。 结 果
          数生长期的PC12细胞，按“2.4”项下方法分组（每组设置                       见表1。


          · 404 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 4                               中国药房  2023年第34卷第4期
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