Page 25 - 《中国药房》2023年4期
P. 25

我国高原面积广阔，具有重要的政治、军事和经济                         sciences 公司）、ChemiDocMP Imaging System 型凝胶成
          地位。气压低、氧含量低是高原环境最主要的特征。大                           像分析系统（美国Bio-Rad公司）等。
          脑对低氧刺激尤为敏感，动物研究和临床试验表明，急                           1.2 主要药品与试剂
          性低压缺氧可导致大脑皮质神经细胞、海马神经细胞损                               7-HEC原料药（纯度98%）由本实验室自制；DMEM
          伤 。当脑神经细胞缺氧时，氧气及营养物质消耗所导                           高糖培养基购自美国 HyClone 公司；胎牛血清（fetal bo‐
            [1]
          致的线粒体损伤、神经细胞丢失、氧化应激或细胞坏死、                          vine serum，FBS）、0.25% 胰酶消化液均购自美国 Gibco
          凋亡、自噬是缺氧性损伤的关键环节               [2―4] ，但目前关于高       公司；青霉素-链霉素双抗购自兰杰柯生物科技有限公
          原低压缺氧致神经细胞损伤的机制及药物研究较少，其                           司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（批
          预防和治疗一直面临着较大压力。可见，探索低压缺氧                           号 20180728）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，
          致神经细胞损伤的发生机制并寻找抗低压缺氧损伤药                            SOD）试 剂 盒（批 号 20190412）、丙 二 醛（malondialde‐
          物具有重要意义。                                           hyde，MDA）试剂盒（批号 20180728）均购自南京建成生
              近年来有研究表明，黄酮类化合物具有改善缺氧损                         物工程研究所 ；CCK-8 细胞活力检测试剂盒（批号
          伤神经的药理作用，如抗氧化、抗炎、抗凋亡作用等                    [5―7] 。  PM508）购自日本Dojindo公司；Annexin Ⅴ-FITC细胞凋
          白杨素（化学名5，7-二羟基黄酮）又名白杨黄素，是来源                        亡检测试剂盒（批号10625-2）购自上海碧云天生物技术
          广、毒性低的黄酮类化合物，具有抗焦虑、抗抑郁和保护                          公 司 ；DNA 含 量 检 测 试 剂 盒（细 胞 周 期）（批 号
                                                [3]
          神经等多种生物活性，但其生物利用度较低 。为了改                           20210105）购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗鼠 Bax
          善白杨素的上述缺点，本课题组通过结构修饰合成了7-                          单克隆抗体（批号 ab32503）、兔抗鼠 Bcl-2 多克隆抗体
          羟乙基白杨素[化学名 5-羟基-7-羟乙氧基黄酮，英文名                      （批号ab196495）、兔cleaved caspase-3多克隆抗体（批号
                                              [8]
          7-hydroxyethyl chrysin，以下简称“7-HEC”] ；药理研究          ab184787）均购自美国 Abcam 公司；鼠 β-肌动蛋白（β-
          表明，7-HEC 能改善低压缺氧诱导的脑组织损伤、认知                        actin）单克隆抗体（批号TA-09）、辣根过氧化物酶标记的
          功能障碍，并能逆转缺氧模型大鼠海马神经细胞损伤 ，                          山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批号ZB-2307）均购自北京
                                                       [9]
          但具体机制尚不清楚。PC12细胞是研究神经生理和神                          中杉金桥生物技术有限公司。
          经药理的常用细胞之一，本课题组为了更好地模拟高原                           1.3 细胞
          环境，在单纯缺氧模型的基础上进行改良，建立了PC12                             大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12购自中国科学
          细胞低压缺氧损伤模型，并证实了低压缺氧可诱导该细                           院上海细胞库。
                [10]
          胞凋亡 。研究指出，抗凋亡蛋白 B 细胞淋巴瘤 2（B-                       2 方法
          cell lymphoma-2，Bcl-2）与促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白             2.1 细胞培养
         （Bcl-2 associated X protein，Bax）的表达比值决定了细胞              将PC12细胞接种于含10%FBS、1%青霉素-链霉素
          凋亡的进程，活化的胱天蛋白酶 3（cleaved caspase-3）则               双抗的 DMEM 高糖培养基（以下简称“完全培养基”）
          是执行细胞凋亡的关键因子，可见，caspase-3/Bax/Bcl-2                中，于 37 ℃、5%CO2 培养箱中培养。待细胞融合至
                                          [11]
          通路是调控细胞凋亡的重要信号通路 。基于此，本研                           80%～90%时，用0.25%胰酶消化并按1∶3比例传代，取
          究拟探讨7-HEC对低压缺氧致PC12细胞损伤的保护作                        对数生长期的细胞进行后续实验。
          用，同时以caspase-3/Bax/Bcl-2通路为线索，探讨该化合                2.2 分组与处理
          物改善低压缺氧致 PC12 细胞损伤的分子机制，以期为                            根据不同培养条件，将PC12细胞分为对照组、低压
          7-HEC 在高原低压缺氧损伤防治领域中的应用提供                          缺 氧 组 和 7-HEC 组 。 对 照 组 细 胞 用 含 10%FBS 的
          参考。                                                DMEM高糖培养基培养24 h；低压缺氧组细胞根据前期
          1 材料                                               确定的低压缺氧模型条件 ，于 5%CO2、94%N2、1%O2、
                                                                                    [10]
          1.1 主要仪器                                           54 004 Pa（与 5 000 m 海拔处大气压相当）条件下培养
              本研究所用主要仪器包括自制压力控制型细胞缺                          24 h；7-HEC组细胞先用含7-HEC的完全培养基培养30
                                               [12]
          氧培养箱（实用新型专利 ZL201821672535 ）、EST-10-               min后，再按低压缺氧组方法培养24 h。
          02 型氧浓度测定仪（深圳市兴源恒通科技有限公司）、                         2.3 细胞存活率检测
          CKX41 型倒置相差显微镜（日本 Olympus 公司）、INC                      采用 CCK-8 法检测。取生长良好且处于对数生长
                                                                                                          4
          153H9T6 型三气培养箱（德国 Memmert 公司）、Spectra‐             期的 PC12 细胞，用 0.25% 胰酶消化后，按每孔 1×10 个
          Maxi3 型全自动荧光酶标仪（美国 Molecular Devices 公             接种于96孔板中。将细胞分为对照组、低压缺氧组、不
          司）、ACEA NovoCyte 型流式细胞仪（美国 ACEA Bio-               同浓度 7-HEC 组（7-HEC 终浓度为 100、10、1、0.1、0.01


          中国药房  2023年第34卷第4期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 4    · 403 ·
   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30