Page 31 - 《中国药房》2023年4期

法建立模型，除空白对照组外，余下2组小鼠均于背部皮 RNA，测定纯度和浓度后，取1 μg RNA配制成20 μL反
下接种 0.1 mL LLC 细胞混悬液（细胞密度约为 1×10 6 应体系，将RNA反转为cDNA。逆转录采用两步法反应
个/mL），空白对照组注射等体积的生理盐水。接种LLC 程序：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 60
细胞混悬液第 7 天观察，除空白对照组小鼠外，其余小 s，40 个循环反应。以 RPS18 为内参，采用２ －ΔΔCt 计算各
鼠可见肿瘤，并于第7天开始每日灌胃给药干预。参考 基因的相对表达量，空白对照组作为统计结果矫正组。
[14]
相关文献 并结合前期预实验结果，欧前胡素组按 60 2.3 统计学分析
mg/kg 灌胃欧前胡素混悬液（溶剂为 0.5%CMC-Na 溶 采用 GraphPad Prism 8.0 软件、SPSS 22.0 软件对数
液），空白对照组和模型组给予等体积 0.5%CMC-Na 溶
据进行统计学分析和作图，数据均以 x±s 表示，多组间
液，连续给药13 d。
比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检
2.2 指标检测
验。检验水准α＝0.05。
2.2.1 一般指标检测 给药期间，每日定时记录小鼠的
3 结果
摄食量和体质量；每两日测量一次肿瘤的长径（x）和短
3.1 欧前胡素对恶病质模型小鼠一般指标的影响
2
径（y），计算肿瘤体积V（V＝x×y /2）；取材当日称量肿瘤
与空白对照组比较，模型组小鼠体质量、骨骼肌质
质量和骨骼肌质量，并计算去瘤体质量。
量均显著降低（P＜0.05），摄食量有所下降；与模型组比
2.2.2 取材 末次给药结束后，用 1% 戊巴比妥按体质
量5 mL/kg对小鼠进行麻醉，然后颈椎脱臼处死小鼠，取 较，欧前胡素组小鼠经过给药干预后体质量下降的变化
下肿瘤和双侧后肢骨骼肌，将部分骨骼肌置于 4% 多聚 速度有所减缓，最终的体质量、去瘤体质量、骨骼肌质量
甲醛中固定，剩余部分放在－80 ℃冷冻保存用于后续实 均显著升高（P＜0.05），摄食量有所提高，同时肿瘤质量
验检测。 和肿瘤体积均显著降低（P＜0.05），表明欧前胡素在抗

2.2.3 骨骼肌病理学检测和纤维横截面积计算 将 肿瘤恶病质的基础上兼有抗肿瘤功效。结果见图1。
4% 多聚甲醛固定的骨骼肌组织包埋于石蜡中，制作石 30 Ⅰ 20 Ⅰ
28 Ⅱ 16 Ⅱ
蜡切片，用常规方法进行HE染色，于显微镜下观察病理 26 b Ⅲ 12 Ⅲ
变化，采集图片。另取石蜡切片进行WGA染色，观察骨 体质量/g 24 a 摄食量/g 8
骼肌纤维横截面积的变化，每组测量 100 个骨骼肌纤维 22 4
20 0
横截面积大小，并使用Image Pro Plus 6.0软件对小鼠骨 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 8 10 12 14 16 18 20
时间/d 时间/d
骼肌纤维横截面积进行计算。 A.各组小鼠体质量变化图 B.各组小鼠摄食量变化图
2.2.4 骨骼肌萎缩和凋亡相关蛋白表达检测 采用 30
1 000
Western blot法进行检测。取出部分存于－80 ℃的各组 800 Ⅱ 28 b
Ⅲ
小鼠骨骼肌用于总蛋白提取，BCA 法测量蛋白浓度，对 肿瘤体积/mm 3 600 b 体质量/g 26 a
400
蛋白浓度进行调平。每组动物均随机选取3个蛋白样本 200 24
进行实验，蛋白经 10%SDS-PAGE 电泳分离后，电转至 0 22
6 8 10 12 14 16 18 20
PVDF 膜上，5% 牛血清白蛋白封闭 1 h，分别加入 β-tu‐ 时间/d 20
C.模型组和欧前胡素组小鼠肿瘤 Ⅰ Ⅱ Ⅲ
bulin、p-STAT3、STAT3、Myog、MAFbx、Bcl-2、Bax、Cas‐ 体积变化图 D.各组小鼠体质量比较图
pase3一抗（稀释比均为1∶1 000），于4 ℃摇床孵育过夜。 30 2.0 0.45
次日用TBST洗膜4次，每次5 min，加入相应二抗（稀释 28 1.5 0.40 b
比均为 1∶10 000），常温孵育 1 h 后，用 TBST 洗膜 3 次， 去瘤体质量/g 26 b 肿瘤质量/g 1.0 骨骼肌质量/g 0.35 a
每次 5 min，ECL 化学发光法显影成像。收集图片，使 24 a b 0.30
0.5
用 Image J 软件进行灰度值计算，以目标蛋白与内参 22 0.25
β-tubulin 灰度值的比值作为其表达量，以 p-STAT3 与 20 0 0.20
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ
STAT3灰度值的比值反映STAT3的磷酸化水平，空白对 E.各组小鼠去瘤 F.各组小鼠肿瘤 G.各组小鼠骨骼肌
照组作为统计结果矫正组。 体质量比较图 质量比较图 质量比较图
Ⅰ：空白对照组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：欧前胡素组；a：与空白对照组比
2.2.5 骨骼肌萎缩和凋亡相关基因表达检测 采用实 较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
时荧光定量 PCR 法进行检测。取 20 mg 骨骼肌，加入 1 图 1 欧前胡素对恶病质模型小鼠一般指标的影响
mL Trizol，放入研磨机中低温匀浆裂解，提取组织总 （n＝5）

中国药房 2023年第34卷第4期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 4 · 409 ·