Page 38 - 《中国药房》2023年1期
P. 38

松散，肌束排列紊乱，裂隙明显变宽、变多，细胞核周围                               结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠心肌组
          空泡化。各给药组小鼠心肌细胞轻微水肿，心肌结构较                            织中 IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 表达水平均显著升高
          为清晰，肌束紊乱程度改善；其中芒果苷组小鼠心肌纤                           （P＜0.05）；与模型组比较，芒果苷低、高剂量组小鼠心
          维排列紧密，且较为整齐，心肌损伤较其余给药组相对                            肌组织中上述指标表达水平均有降低趋势，且芒果苷高
          较轻。结果表明，芒果苷、知母皂苷 AⅢ、知母皂苷 BⅡ                         剂量组小鼠心肌组织中 IL-1β、TNF-α mRNA 表达水平
          均能减轻模型小鼠心肌组织的病理损伤，其中以芒果苷                            差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，芒果苷可
          效果相对较好。                                             抑制脓毒症性心肌损伤小鼠心肌组织中炎症因子的表达。
          2.4 芒果苷对模型小鼠心肌组织中炎症因子mRNA表                          2.5 芒果苷对模型小鼠心肌组织中ROS水平的影响
          达的影响                                                    取“2.4.1”项下相应分组小鼠心肌组织冰冻切片，加
          2.4.1 分组、给药及取材 将32只小鼠按体质量随机分                        200 µL清洗工作液，静置10 min，滴加100 µL DCFH-DA
          为4组，分别为正常对照组、模型组和芒果苷低、高剂量                           染色工作液，于 37 ℃避光孵育 30 min；移除染色液，以
          组（20、50 mg/kg），每组8只。参考“2.3.2”项下方法进行                 PBS洗涤2次，加DAPI染色工作液适量，于37 ℃避光孵
          造模和给药：正常对照组小鼠腹腔注射生理盐水；模型                            育10 min；移除染色液，以PBS洗涤2次后，加盖玻片，于
          组和给药组小鼠腹腔注射 10 mg/kg 脂多糖构建脓毒症                       激光共聚焦显微镜下拍照。结果见图4。
          性心肌损伤模型。脂多糖注射前 1 h 和注射后 12 h，给                          由图4可知，与正常对照组比较，模型组小鼠心肌组
          药组小鼠灌胃相应药物，共给药2次；正常对照组和模型                           织中ROS水平明显增加；与模型组比较，芒果苷低、高剂
          组小鼠灌胃等体积生理盐水，灌胃体积均为 10 mL/kg。                       量组小鼠心肌组织中ROS水平明显减少。结果表明，芒
          造模24 h后脱颈处死小鼠，立即取其心脏。取部分小鼠                          果苷可有效降低脓毒症性心肌损伤小鼠心肌组织中
          心脏制作组织冰冻切片，剩余组织于－80 ℃保存。                            ROS水平。
          2.4.2 样本检测 采用实时荧光定量PCR法进行检测。                        3 讨论
                    ®
          采用 Eastep  Super 总 RNA 提取试剂盒提取上述小鼠心                     脓毒症性心肌损伤的发病机制复杂，目前仍没有特
                                                                        [15]
          肌组织总 RNA，采用超微量紫外-可见分光光度计测定                          效治疗方法 。因此，寻找安全有效的药物具有重要的
          RNA 纯度和浓度；按照逆转录试剂盒方法将 RNA 反转                        临床意义。知母总双苯吡酮类和总皂苷类成分均具有
          录为 cDNA，并以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。按照试                    抗炎、抗氧化应激、心血管保护等作用               [16―17] ，但目前对于
          剂盒说明书方法将 cDNA、上下游引物、SYBR Green                      知母应用于脓毒症性心肌损伤的研究鲜有报道。本研
          Master Mix和ddH2O加至八联管中，瞬离，上机（95 ℃预                  究发现，知母不同活性部位（知母总双苯吡酮、知母总皂
          变性 30 s；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 40 个           苷、知母水提物）均可明显提高脓毒症性心肌损伤模型
          循环），采用 2    －ΔΔCt  法计算目标因子的 mRNA 表达水平。              小鼠的存活率，该结果初步表明知母不同活性部位对脓
          引物序列及扩增产物长度见表1。                                     毒症性心肌损伤均具有改善作用，且以知母总双苯吡酮
                    表1 引物序列及扩增产物长度                            部位的效果较好。
           基因名称     上游引物（5′→3′）       下游引物（5′→3′）  扩增产物长度/bp      本课题组前期研究发现，芒果苷、知母皂苷 AⅢ和
           GAPDH GGTTGTCTCCTGCGACTTCA  TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC  183  知母皂苷 BⅡ在知母中含量较高，且 2020 年版《中国药
           IL-6  CTCCCAACAGACCTG TCTATAC  CCATTGCACAACTCTTTTCTCA  97  典》（一部）以芒果苷和知母皂苷BⅡ作为知母的质控成
           IL-1β  CACTACAGGCTCCGAGATGAACAAC TGTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTAC  145
                                                                [6]
           TNF-α  AGGGGATTATGGCTCAGGGT  CCACAGTCCAGGTCACTGTC  92  分 。查阅相关文献发现，芒果苷、知母皂苷AⅢ和知母
          2.4.3 检测及统计分析结果 采用SPSS 24.0软件对数                     皂苷BⅡ在抗氧化应激、抗炎和保护心脑血管疾病方面
          据进行统计分析。数据以x±s表示，多组间比较采用单                           的现代药理研究较多          [9—11] 。因此本研究紧接着对芒果
          因素方差分析，方差齐者组间两两比较采用 LSD 检验，                         苷、知母皂苷 AⅢ和知母皂苷 BⅡ这 3 个单体成分进行
          方差不齐者采用Dunnett’s T3检验。检验水准α＝0.05。                   药效研究。结果发现，芒果苷和知母皂苷AⅢ均能提高
          结果见表2。                                              脓毒症性心肌损伤模型小鼠存活率，知母皂苷BⅡ能够
          表2 芒果苷对脓毒症性心肌损伤模型小鼠心肌组织中                            延缓小鼠死亡时间，三者均能够改善脓毒症性心肌组织
               炎症因子mRNA表达的影响（x±s，n＝8）                         病理形态学损伤，其中芒果苷在提高模型小鼠存活率、
           组别            IL-6 mRNA   IL-1β mRNA  TNF-α mRNA   延缓死亡时间及减轻心肌病理损伤方面效果更好。同时，
           正常对照组          1.32±0.90   1.22±0.84  1.05±0.33    芒果苷属于知母总双苯吡酮类成分，这也与知母不同提
           模型组           50.73±18.43 a  11.28±4.60 a  4.09±0.10 a  取部位的药效筛选结果一致。此外，炎症是脓毒症性心
           芒果苷低剂量组       32.63±11.96  6.06±2.01  3.59±1.02
           芒果苷高剂量组       27.92±10.58  5.38±1.84 b  3.14±0.53 b  肌损伤的潜在诱因，大量炎症介质会诱导 ROS 的产生，
                                                                          [18]
             a：与正常对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05                加重心肌损伤 。本研究发现，芒果苷干预组小鼠心肌

          · 32 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 1                                中国药房  2023年第34卷第1期
   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43