Page 26 - 《中国药房》2023年1期

通过超滤离心法测定脂质体对 AB4 的包封率 。 和AB4/siP-c-L混悬液，置于截留分子量为10 kDa的透析
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将 400 μL AB4/siP-c-L 混悬液置于 Ultra-4 超滤离心管 袋中，然后将透析袋分别置于 100 mL 不同 pH（pH7.4、
（截留分子量为10 kDa）中，以10 000 r/min离心15 min， 6.0、5.0）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于37 ℃、150 r/min条
收集滤液；取滤液按上述色谱条件进样测定，得到脂质 件下考察AB4/siP-c-L中AB4在PBS中的释放行为。分
体中游离 AB4 的含量（Mfree ）。取 400 μL AB4/siP-c-L 混 别于 0.5、1、2、4、 8、12、24、48 h时取样，同时补充相同温
悬液 V 脂质体，用甲醇稀释至 2 mL，然后按上述色谱条 度和相同体积的释放介质，按“2.2.3”项下方法测定释放
件进样测定，得到脂质体中 AB4 的总量（Mtotal）。通过 介质中 AB4 的含量。每个时间点平行测定 3 次。以释
下列公式分别计算脂质体中 AB4 的包封率和药物含 放时间为横坐标、AB4累积释放率为纵坐标绘制释放曲
量：包封率（%）＝（Mtotal－Mfree ）/Mtotal×100%；药物含量＝ 线，结果见图4。如图4所示，与AB4溶液相比，AB4/siP-
（Mtotal－Mfree ）/V 脂质体。结果显示，AB4在AB4/siP-c-L中的 c-L 中 AB4在不同pH条件下均未见明显突释，说明AB4/
包封率为（95.2±0.4）%，含量为（1.0±0.2） mg/mL。 siP-c-L 具有缓释作用。同时，AB4/siP-c-L 的释放具有
2.2.4 siP包裹能力考察 采用琼脂糖凝胶电泳法考察 pH 敏感性，随着 pH 的降低，AB4/siP-c-L 中 AB4 的释放
脂质体对 siP 的包裹能力。将 AB4-c-L 与 20 nmol/L siP 越快；在 pH5.0 条件下，AB4/siP-c-L 中 AB4 的 48 h 累积
释放率分别是pH6.0、pH7.4条件下的1.4、2.4倍。
混合，使得 AB4-c-L 混悬液中 DOTAP 的氮（N）与 siP 中
的磷（P）的物质的量之比为10∶1，室温孵育30 min，作为 100 AB4/siP-c-L（pH5.0）
AB4/siP-c-L（pH6.0）
样品；以等量的游离 siP（20 nmol/L）和 AB4-c-L 混悬液 80 AB4/siP-c-L（pH7.4）
AB4溶液（pH5.0）
作为阴性对照样品，同法操作。将上述样品分别与上 60 AB4溶液（pH6.0）
AB4溶液（pH7.4）
样缓冲液混合，依次上样进行琼脂糖凝胶电泳（电压 AB4累积释放率/% 40
75 mV，时间 60 min），于凝胶成像系统中成像。结果显
示，当 AB4-c-L 中 N 和 P 的物质的量之比为 10∶1 时，电 20
0
泳条带消失，提示 AB4-c-L 可将 siP 完全包裹。结果 0 6 12 18 24 30 36 42 48
时间/h
见图2。
图4 AB4/siP-c-L中AB4在不同pH释放介质中的体外
释放曲线（x±s，n＝3）

2.3 LLC细胞对脂质体的摄取考察
2.3.1 流式细胞术检测 采用流式细胞术考察 LLC 细
胞对荧光标记制剂的摄取量。将 LLC 细胞按每孔
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siP AB4-c-L AB4/siP-c-L 1×10 个接种于24孔板上，在37 ℃、5%CO2培养箱中孵
图2 AB4/siP-c-L对siP的包裹能力考察的电泳图 育 24 h 至细胞贴壁。将细胞分为空白对照组、siP 组、
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2.2.5 血清稳定性考察 将 AB4/siP-c-L 与 FBS 等体积 AB4/siP -L 组、AB4/siP -c-L 组，每组设置 3 个复孔。
混合，在 37 ℃孵育，分别在 0、1、2、4、8、12、24 h 时取出 空白对照组细胞给予常规培养基，给药组细胞分别加入
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24 μL的AB4/siP-c-L于离心管中，向离心管中加入6 μL siP 、AB4/siP -L、AB4/siP -c-L（siP 的浓度均为 20
上样缓冲液，涡旋混匀，作为待测样品；以等量的游离 nmol/L，AB4的浓度均为1.6 μmol/L）。将细胞置于培养
siP（20 nmol/L）作为阴性对照样品，同法操作。将上述 箱中分别常规培养 15、30、60 min 后，用 PBS 清洗细胞 3
样品分别上样至 1.2% 的琼脂糖凝胶各泳道中，设置电 次，加入适量胰酶进行消化，收集细胞至流式管中。采
泳参数为电压75 mV、时间60 min，采用凝胶成像系统成 用流式细胞仪检测孵育不同时间后细胞对荧光标记制
像。结果显示，游离的 siP 在 FBS 中 2 h 后开始降解（条 剂的摄取量。采用Graphpad Prism 8软件对结果进行统
带颜色变浅），且时间越长，降解越完全；而 AB4/siP-c-L 计分析。计量资料以 x±s 表示，多组间比较采用单因
在 FBS 中 8 h 后仍存在，表明 AB4/siP-c-L 能提高 siP 在 素方差分析，方差齐性时组间两两比较采用 Tukey’s
检验，方差不齐时组间两两比较采用 Dunnett’s T3 检
血清中的稳定性。结果见图3。
验。检验水准 α＝0.05。结果显示，在孵育 15、30、60
0 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h
siP min后，3个给药组细胞的荧光摄取量较空白对照组均显
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著升高（P＜0.05），其中 AB4/siP -c-L 组细胞的荧光摄
AB4-siP-c-L
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取量又显著高于 siP 组和 AB4/siP -L 组（P＜0.05），
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图3 AB4/siP-c-L血清稳定性考察的电泳图 且随着孵育时间的延长 AB4/siP -L 组、AB4/siP -c-L
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2.2.6 体外释放行为考察 采用透析袋扩散法考察 组细胞的荧光摄取量均显著升高（P＜0.05）。结果
AB4/siP-c-L 的体外释放行为。分别取适量的 AB4 溶液 见表1。
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