Page 31 - 《中国药房》2023年1期
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2 方法                                               析各组蛋白的荧光强度（荧光强度越大，表示蛋白表达
          2.1 药物制备                                           水平越高）。
              按照文献[10]方法将 XBN 的 11 味中药按处方比例                  2.5 大鼠软骨组织中分解代谢相关基因mRNA表达水
          称取适量，将除淡附片、紫河车的其余9味中药加8倍量                          平的检测
         （g/mL，下同）水浸泡 30 min。用武火将淡附片煎至沸                          采用qPCR方法进行检测。每组随机取3只大鼠冻
          腾，再以文火煎30 min，加入上述浸泡后的中药，煎至沸                       存的软骨组织，经液氮研磨裂解后，常规提取软骨组织
          腾后继续煎煮 30 min，滤过；再加 6 倍量水，煎至沸腾后                    总 RNA，再逆转录为 cDNA。以 cDNA 为模板，进行
          再煎 30 min，滤过；合并 2 次滤液，最后加入研磨成粉的                    PCR（PCR引物序列和产物长度见表1）。PCR反应体系
          紫河车，浓缩成质量浓度为 1.2 g/mL（以生药量计）的                      为上、下游引物各 0.4 µL，cDNA 1 µL，2×SYBR qPCR
          XBN溶液。                                             Master  Mix  10  µL，ddH2O  8.2  µL。 PCR 反 应 条 件 为
          2.2 动物分组、给药与造模                                     95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃
              将大鼠随机分为空白组、模型组、XBN 组（12.56                     延伸 20 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参，采用 2           －ΔΔCt
          g/kg，剂量为临床等效剂量）和 XBN+二甲双胍组（12.56                   法计算各目的基因mRNA的表达水平。
          g/kg XBN+100 mg/kg二甲双胍，二甲双胍剂量参考文献                            表1 PCR引物序列和产物长度
          [13]设置），每组9只。空白组大鼠仅切开皮肤而不开放                         基因           引物序列（5′→3′）             扩增产物长度/bp
          膝关节腔，其余各组大鼠采用离断前交叉韧带的方法建                            ADAMTS-4     上游：AACTCACCTGCCAGGCCC      186
                                                                           下游：CATTCCCACCGCACACCA
          立 KOA 模型 ，具体方法如下：用 2% 戊巴比妥钠（50
                     [14]
                                                              ADAMTS-5     上游：AGCCCTAAAGAAGAAAAC      138
          mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，备皮、消毒，纵向切口打开                                     下游：ATCCCATGTAAAAAATCA
          膝关节腔，髌骨脱位后用手术刀离断前交叉韧带，然后                            MMP-3        上游：CCTGATGTCCTCGTGGTA      156
                                                                           下游：GGTCCTGAGAGATTTTCG
          逐层缝合；术后连续肌内注射青霉素钠3 d以预防感染。
                                                              MMP-13       上游：CCCTAAGCACCCCAAAAC      114
          造模 14 d 后，大鼠前抽屉试验阳性，表明造模成功。空                                     下游：TGCAGACGCCAGAAGAAT
          白组与模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，各给药组大鼠                            GAPDH        上游：GGCTCTCTGCTCCTCCCTGT    95
                                                                           下游：CGTTCACACCGACCTTCACC
          给予相应药物，XBN 和生理盐水每天灌胃 1 次，二甲双
                                                             2.6 大鼠软骨组织中分解代谢和 AMPK/mTOR 信号
          胍隔天腹腔注射1次，连续4周。
                                                             通路相关蛋白表达水平的检测
          2.3 大鼠软骨组织病理形态学观察
              采用番红 O-固绿染色法进行检测。末次给药 24 h                         采用 Western blot 法进行测定。每组随机取 3 只大
                                                             鼠冻存的软骨组织，经液氮研磨裂解后，离心，取上清液
          后，将各组大鼠处死，剖取软骨组织。取3只大鼠的软骨
          组织（其余大鼠软骨组织于－80 ℃下保存备用）清理干                         15 μL测定蛋白含量，其余上清液煮沸变性，然后进行十
                                                             二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，以 5% 脱脂
          净后流水冲洗，置于 4% 多聚甲醛中固定 3～5 d，再以
          10% EDTA溶液脱钙4周；经梯度浓度的乙醇脱水、二甲                       奶粉封闭 1 h；加入 GAPDH、ADAMTS-4、ADAMTS-5、
          苯透明、浸蜡包埋后，切片（厚度为 5 μm）；将切片脱蜡                       MMP-3、MMP-13、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR 一
          至水后，进行番红 O-固绿染色，以自来水冲洗后，用 1%                       抗（稀释度分别为 1∶50 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、
          冰醋酸分色3 s，经无水乙醇脱水、二甲苯透明及中性树                         1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000），4 ℃孵育
          胶封片后，观察各组大鼠软骨组织的病理学形态并拍                            过夜；以 TBST 洗膜 10 min×3 次，加入二抗（稀释度为
          照，参照 Mankin 评分标准评估大鼠软骨组织的病理形                       1∶5 000），室温孵育 1 h；以 TBST 溶液洗膜 10 min×3
                  [15]
          态学变化 。                                             次，加入 ECL 显色，采用凝胶成像发光系统显影曝光。
          2.4 大鼠软骨组织中Aggrecan蛋白表达水平的检测                       采用 Image J v1.53f 软件对各组蛋白条带进行分析，以
              采用免疫荧光染色法进行测定。每组随机取3只大                         ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-13 与 内 参
          鼠冻存的软骨组织，按“2.3”项下方法制备石蜡切片，使                        GAPDH 灰度值的比值表示其表达水平；以 p-AMPK 与
          用二甲苯和梯度浓度的乙醇分别进行脱蜡和水合后，滴                           AMPK、p-mTOR 与 mTOR 的灰度值比值表示 AMPK、
          加适量的 EDTA 完成抗原修复，滴加 3%BSA 溶液封闭                     mTOR的磷酸化水平。
          30 min；加入Aggrecan一抗（稀释度为1∶500），于4 ℃孵               2.7 统计学方法
          育过夜；滴加二抗，于室温孵育 1 h；滴加 DAPI 染色液，                        采用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析，使用
          于室温下静置 15 min；用水冲洗后，滴加适量抗荧光淬                       GraphPad 7.04软件绘图。数据以x±s表示，多组间比较
          灭剂，转移组织切片于显微镜下进行观察（Aggrecan 蛋                      采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。
          白的阳性表达呈红色荧光），使用 Image J v1.53f 软件分                 检验水准α＝0.05。


          中国药房  2023年第34卷第1期                                                  China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 1    · 25 ·
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