Page 42 - 《中国药房》2022年24期
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期；若小鼠在 90 s 内未能找到平台，则将其逃逸潜伏期                        作为目标蛋白的表达水平。
          记为90 s。最后1天进行空间探索实验：移去平台，将小                         2.8 统计学方法
          鼠从第3象限对面的入水点放入水中，记录其穿过原平                                采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。数据以
          台所在位置的次数。                                           x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
          2.4 肠道菌群测定                                          比较采用LSD-t法检验。检验水准α＝0.05。
              检测 APP/PS1 阳性模型组、APP/PS1 阴性正常组、                 3 结果
          地黄饮子中剂量组和西药组小鼠的肠道菌群。给药结                             3.1 小鼠Morris水迷宫实验结果
          束后，上述组所有小鼠禁食12 h，采用强制法（即轻轻挤                             定位航行实验结果显示，早期各组小鼠的逃逸潜伏
          压尾根和直肠末端），将要排出的粪便收集在无菌EP管                           期比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），但总体呈逐渐
          中，于－80 ℃冷冻。用基因组提取试剂盒从小鼠粪便中                          下降趋势（结果略）。第4天（表1），APP/PS1阳性模型组
          提取 DNA，并扩增细菌 16Sr RNA 的 V3+V4 区[引物                  小鼠的逃避潜伏期显著长于 APP/PS1 阴性正常组（P＜
          338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和 806R              0.05），提示APP转基因小鼠存在空间学习障碍；与APP/
         （5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）]。取所得 PCR                PS1阳性模型组比较，地黄饮子中、高剂量组和西药组小
          扩增产物，构建微生物多样性测序文库，采用高通量测                            鼠的逃避潜伏期均显著缩短（P＜0.05）。
          序平台进行可变区检测，根据标签进行物种分类、操作                                空间探索实验结果（表 1）显示，APP/PS1 阳性模型
          分类单位（operational taxonomic units，OTU）分析、多样          组小鼠穿过原平台次数显著少于 APP/PS1 阴性正常组
          性分析、样品群落组成分析（维恩图）、细菌属分类水平                          （P＜0.05），表明APP转基因小鼠的记忆能力明显下降；
          和组间群落差异（LDA effect size，LEfSe）分析。上述实                与APP/PS1阳性模型组比较，各药物组小鼠穿过原平台
          验委托北京奥维森基因科技有限公司完成。                                 次数均有不同程度的提高，其中地黄饮子中、高剂量组
          2.5 海马组织CA1区神经细胞病理改变的观察                             和西药组小鼠该指标显著高于与 APP/PS1 阳性模型组
              上述实验结束后，以颈椎脱臼法处死小鼠，取海马                         （P＜0.05）。
          组织，置于 4% 多聚甲醛溶液中固定 24 h，经常规包埋、                          表1 各组小鼠水迷宫实验结果（x±s，n＝6）
          切片、脱蜡后，行苏木精-伊红（HE）染色，再经梯度脱水、
                                                              组别                  逃避潜伏期/s          穿过原平台次数
          二甲苯透明，用中性树胶封片，置于光学显微镜下观察                            APP/PS1阴性正常组        25.26±7.02        5.34±2.32
          其海马组织CA1区神经细胞的病理改变，并使用形态学                           APP/PS1阳性模型组        50.31±9.05 a      1.45±1.31 a
          图像分析系统采集图像。                                         地黄饮子低剂量组            42.49±7.86        2.46±1.73
                                                              地黄饮子中剂量组            39.48±3.25 b      4.12±5.01 b
          2.6 海马组织中Bcl-2、Bax蛋白表达检测                            地黄饮子高剂量组            38.13±3.11 b      4.29±2.86 b
              采用免疫组化法进行检测。取“2.5”项下石蜡切片，                       西药组                 39.24±9.56 b      4.07±1.51 b
          脱蜡后用水浸洗，消除内源性过氧化物酶活性并抗原修                               a：与APP/PS1阴性正常组比较，P＜0.05；b：与APP/PS1阳性模型组
          复后，滴加Bcl-2、Bax一抗（稀释比例均为1∶100）和HRP                   比较，P＜0.05
          标记的IgG二抗（稀释比例为1∶300）。经DAB显色剂显                       3.2 小鼠肠道菌群检测结果
          色、苏木精复染、脱水透明后，用中性树脂封片，置于光                           3.2.1 肠道菌群 α 多样性分析 微生物群落的丰富度
          学显微镜下观察（细胞质为棕色或深棕色的为相应蛋白                            和多样性可通过多样性分析（α 多样性）来反映，其中
          表达阳性细胞）。于高倍镜下随机选取 5 个视野，采用                          Chao1是用于估计群落中OTU数量的物种丰富度指数，
                                                                                                        [9]
          Image Pro Plus 6.0 软件对 Bax、Bcl-2 蛋白的表达进行定           Shannon 则可用来评估样品中微生物的多样性 。由
          量分析，以平均光密度值作为结果。                                    Chaos1 指数检测结果（图 1A）可知，APP/PS1 阳性模型
          2.7 海马组织中BDNF蛋白表达的检测                                组的 OTU 数量显著高于其余组，地黄饮子中剂量组的
              采用 Western blot 法进行检测。取各组小鼠海马组                  OTU 数量显著低于其余组（P＜0.05）。由 Shannon 指数
          织适量，剪碎后加入裂解液，放入匀浆器充分裂解，于                            检测结果（图1B）可知，地黄饮子中剂量组的多样性显著
          4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10 min，取上清液，采用 BCA            高于 APP/PS1 阳性模型组和西药组（P＜0.05），可推测
          法测定蛋白浓度后加入上样缓冲液，取总蛋白50 μg，金                         中剂量的地黄饮子可降低 APP 转基因小鼠的某些优势
          属浴中加热 8 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白，经                         菌种的数量，但可提高菌种的多样性。
          12%SDS-PAGE 分离后转至硝酸纤维素膜上。以 5% 脱                     3.2.2 样品群落组成分析 韦恩图中各组的交叉椭圆
          脂牛奶在室温下封闭1 h，加入BDNF、β-actin一抗（稀释                    环可反映各样本之间共同存在和单独存在的 OTU 数
          比例分别为1∶500、1∶1 000），4 ℃孵育过夜；用TBST缓                  量。由图2可知，4组之间共有的OTU为686个，占绝大
          冲液洗膜洗涤 5 min×3 次，加入相应二抗（稀释比例为                       多数。APP/PS1 阳性模型组的 OTU 为 892 个，APP/PS1
          1∶1 000），室温孵育1 h；同法洗膜后，使用形态学图像分                     阴性正常组为854个，地黄饮子中剂量组为898个，西药
          析系统进行扫描显影，采用Image J 5.0软件计算条带灰                      组为877个。APP/PS1阴性正常组独有的OTU最多，为
          度值，并以目标蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值                       16 个；APP/PS1 阳性模型组独有 13 个，地黄饮子中剂量


          · 2980 ·    China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 24                            中国药房  2022年第33卷第24期
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