Page 26 - 《中国药房》2022年24期
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亚砜 150 μL，避光振荡 10 min。使用酶标仪于 570 nm                 色，于显微镜下观察并拍照（活细胞的细胞核呈蓝紫色，
          处测定吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率（inhibition                     细胞质呈淡红色；凋亡细胞则表现为核染色质致密浓
          rate，IR）及半数抑制浓度（IC50 ）。IR＝（空白对照组平均                  缩、核碎裂等） 。
                                                                          [9]
          A 值－给药组平均 A 值）/空白对照组平均 A 值×100%。                    2.8 SPS对SMMC-7721细胞自噬影响的观察
          实验重复3次。根据细胞增殖抑制结果，确定受试细胞、                               采 用 AO 染 色 法 进 行 观 察 。 取 对 数 生 长 期 的
          最适细胞浓度和最佳干预时间进行后续实验。                                SMMC-7721细胞，按每孔2.5×10 个/mL接种于24孔板
                                                                                          5
          2.4 SPS对SMMC-7721细胞凋亡影响的观察                          中，每孔 1 mL。培养 24 h 待细胞贴壁后，吸去培养液。
              采用Hoechst 33258染色法进行检测。根据“2.3”项                 按“2.4”项下方法分组、给药。培养48 h后，吸去培养液，
          下结果，取对数生长期的 SMMC-7721 细胞，按每孔 5×                     用 PBS 清洗后，用 0.01% AO 染液避光染色 15 min；用
            5
          10 个/mL接种于12孔板中，每孔2 mL，培养24 h待细胞                    PBS 清洗后，于荧光显微镜下观察并拍照（正常细胞呈
          贴壁后，吸去培养液。将细胞分为对照组和SPS低、中、                          绿色荧光，发生自噬的细胞呈红色荧光）。
          高浓度（20、40、80 μmol/L）组，每组设置3个复孔。对照                   2.9 SPS 对 SMMC-7721 细胞凋亡、自噬及 PI3K/Akt/
          组加入培养基，各药物组加入含相应浓度 SPS 的培养                          mTOR信号通路相关蛋白表达影响的检测
          基，培养48 h。取各组细胞，以4%多聚甲醛溶液固定约                             采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的
          20 min 后，用 PBS 清洗，每孔加入 Hoechst 33258 染色液                                        5
                                                              SMMC-7721细胞，按每孔2.5×10 个/mL接种于24孔板
          100 μL，在室温条件下避光染色 10～15 min，用 PBS 清
                                                              中，每孔 1 mL。培养 24 h 待细胞贴壁后，吸去培养液。
          洗，于荧光显微镜下观察并拍照（活细胞的细胞核呈弥
                                                              按“2.4”项下方法分组、给药。培养 48 h 后，细胞用胰酶
          散均匀的淡蓝色荧光，凋亡细胞核则可见致密浓染的颗
                                                              消化并低温离心。所得细胞经裂解液裂解后，提取其总
          粒块状亮蓝色荧光）。
                                                              蛋白，采用 BCA 法进行蛋白定量。取变性后的蛋白样
          2.5 SPS对SMMC-7721细胞迁移能力影响的检测
                                                              品 40 μg 进行 SDS-PAGE 分离，湿法转膜后封闭，加入
              采用划痕实验进行检测。取对数生长期的SMMC-
                                                              β -actin、cleaved  caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、p62、
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          7721 细胞，按每孔 1.2×10 个/mL接种于 6 孔板中，每孔
                                                              LC3、beclin-1、PI3K、mTOR、Akt 一抗（β-actin 的稀释比
          2 mL，培养 24 h 待细胞贴壁后，吸去培养液，用 200 μL
                                                              例为 1∶5 000，其余均为 1∶1 000），于 4 ℃下孵育过夜；
          移液枪枪头在每孔底部中央作一划痕，用PBS清洗。按
                                                              TBST溶液清洗3次后，加入二抗（稀释比例为1∶5 000），
         “2.4”项下方法分组、给药。分别于培养 0、24、48 h 时用
                                                              常温孵育 2 h；TBST 溶液清洗 3 次后，用 ECL 化学发光
          显微镜观察，采用 Image J 软件分析并计算各组细胞的
                                                              液显影。使用 Image J 软件对蛋白条带进行分析，以目
          迁移率：细胞迁移率＝（T0时划痕面积－Tt时划痕面积）/
                                                              标蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值作为目标蛋白
          T0时划痕面积×100%（式中，T0为0 h，Tt为24或48 h）。
                                                              的相对表达量[其中，LC3蛋白的相对表达量以LC3Ⅱ与
          2.6 SPS 对 SMMC-7721 细胞克隆形成能力影响的
                                                              LC3Ⅰ比值（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）表示]。
          检测
                                                              2.10 统计学方法
              采用克隆实验进行检测。取对数生长期的SMMC-
                                                                  采用 SPSS 24.0 软件和 GraphPad Prism 8 软件对数
                               4
          7721 细胞，按每皿 5×10 个/mL 接种于培养皿（直径 35
                                                              据进行统计分析。所有数据均以x±s表示，多组间比较
          mm）中，每皿 3 mL，培养 24 h 待细胞贴壁后，吸去培养
                                                              采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。
          液，用PBS清洗。按“2.4”项下方法分组、给药。培养5 d
                                                              检验水准α＝0.05。
          后，弃去上清液，细胞用 PBS 清洗，每孔加入甲醇适量，
          于室温下固定15 min，再用PBS清洗，加入5%结晶紫溶                       3 结果
          液染色30 min，用水洗净，晾干，于显微镜下观察拍照并                        3.1 SPS对不同人肝细胞增殖的抑制作用
          计算细胞克隆形成率：细胞克隆形成率＝（细胞克隆数/                               SPS干预24、48、72 h均可抑制人肝癌HepG2等3种
          接种细胞数）×100%。                                        细胞的增殖，并且抑制作用（以IR平均值表示）有随浓度
          2.7 SPS对SMMC-7721细胞形态影响的观察                          上升而增强的趋势（图1）。干预48 h时，SPS对SMMC-
              采 用 HE 染 色 法 进 行 观 察 。 取 对 数 生 长 期 的            7721细胞的IC50[（73.44±0.79）μmol/L]显著低于该成分
          SMMC-7721细胞，按每孔2.5×10 个/mL接种于24孔板                   对 HepG2、Huh-7 细 胞 的 IC50[（74.16±0.84）、（78.39±
                                       5
          中，每孔 1 mL。培养 24 h 待细胞贴壁后，吸去培养液。                     0.61）μmol/L]（P＜0.05）。基于此，后续研究以更为敏感
          按“2.4”项下方法分组、给药。培养 48 h 后，细胞用 4%                    的 SMCC-7721 细胞作为研究对象，药物干预时间设为
          多聚甲醛溶液固定约20 min后，用PBS清洗，再用HE染                       48 h，药物低、中、高浓度分别为20、40、80 μmol/L。


          · 2964 ·    China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 24                            中国药房  2022年第33卷第24期
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