Page 25 - 《中国药房》2022年24期
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Akt/mTOR signaling pathway.
          KEYWORDS    Safflower  polysaccharide；  human  hepatocellular  carcinoma  cells；  SMMC-7721；  apoptosis；  autophagy；  phosphatidyl
          inositol-3-kinase/protein kinase B/mammals rapamycin target protein signaling pathways


              肝癌是较为常见的原发恶性肿瘤之一，具有发病                          色试剂盒、Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（批
          率、病死率较高和预后差等特点，是目前人类难以攻克                           号分别为 I314FA0005、TE55AA6547）均购自生工生物
                    [1]
          的病症之一 。红花多糖（safflower polysaccharide，SPS）         （上海）股份有限公司；兔源 β-肌动蛋白（β-actin）、Bax、
          是中药红花 Carthamus tinctorius L. 的主要活性成分之             Bcl-2、胱 天 蛋 白 酶 9（caspase-9）、剪 切 的 caspase-3
          一，与化疗药物联用有增强后者疗效、降低后者毒副作                          （cleaved caspase-3）、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-
          用的效果    [2－3] ；同时有研究证实，SPS 能通过调控细胞凋                associated  protein  1  light  chain  3，LC3）、beclin-1、p62、
          亡和细胞周期来发挥对胃癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤细                           Akt、PI3K、mTOR单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊
                           [4]
          胞增殖的抑制作用 。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphati‐                    抗 兔 IgG 二 抗（批 号 分 别 为 F200040、#83m8093、
          dylinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase   #83m4297、#84g5912、#85t5319、#84g5724、#83m8311、
          B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of             #83m5104、#84g5897、#84g5905、#84g5931、#83m8112）
          rapamycin，mTOR）通路是肝癌细胞内的重要信号通路，                    均购自美国 Affinity Biosciences 公司；其余试剂均为分
          其相关蛋白异常将导致通路功能改变，从而影响肿瘤细                           析纯，水为蒸馏水。
                                  [5]
          胞的增殖、凋亡、转移和侵袭 。研究表明，自噬可促进                          1.3 细胞
                                                       [6]
          肿瘤细胞凋亡或坏死，与肿瘤的发生发展密切相关 。                               人肝癌 HepG2、SMMC-7721、Huh-7 细胞株均购自
                                        [2]
          SPS 具有诱导肝癌细胞凋亡的作用 ，但其能否通过调                         上海富衡生物科技有限公司，由黑龙江中医药大学中药
          节自噬来抑制肿瘤的发生发展及具体作用机制尚不清                            药剂细胞实验室进行传代保种。
          楚。为此，本研究以人肝癌细胞作为研究对象，研究SPS                         2 方法
          对其自噬与凋亡的影响，初步探讨SPS抗肝癌的潜在作                          2.1 SPS提取纯化
          用机制，以期为临床治疗提供理论支持。                                     取红花药材适量，按本课题组前期所得最优条件
          1 材料                                               [料液比 1∶16.7（mg/mL）、提取温度 91.4 ℃、提取时间
          1.1 主要仪器                                           89.8 min]进行提取，得粗制 SPS；粗制 SPS 经冷冻离心
              本研究所用主要仪器包括Friocell 22型CO2恒温培                  后，取上清液按 Sevage 法除去游离蛋白，反复脱脂后洗
          养箱（德国 Mmm Group 公司），Infinite 50 型酶标仪（美             涤、干燥，即得淡黄色的精制SPS（每1 g精制SPS相当于
          国BioTek公司），DYCZ-2DN型电泳仪、WD-9423B型化                 红花生药 261.8 g，以苯酚-硫酸法测得质量分数为
                                                                    [7]
          学发光分析仪（北京六一生物科技有限公司），BD                            95.82%） 。将所得精制 SPS 溶于 DMEM 培养基中，配
          Accuri C6型流式细胞分析仪（美国BD公司），CKX41型                   制成浓度为200 μmol/L的SPS溶液 ，涡旋混匀，经0.45
                                                                                            [8]
          光学显微镜（日本Olymypus公司），EOS 700D型数码相                   μm滤膜滤过后冷存，备用。
          机（日本 Canon 公司），DMi1 型荧光倒置显微镜（德国                    2.2 细胞培养
          Leica公司）等。                                             将人肝癌 HepG2、SMMC-7721、Huh-7 细胞接种于
          1.2 主要药品与试剂                                        含有10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的DMEM培养
              红花药材（批号 200301）购自黑龙江雪灵峰中药饮                     基中，置于 37 ℃、5%CO2 的培养箱中培养（培养条件
          片有限公司，经黑龙江中医药大学中药药剂教研室王锐                           下同）。
          教授鉴定为菊科红花属植物红花 C. tinctorius L. 的干                 2.3 SPS对不同人肝癌细胞增殖影响的检测
          燥花。                                                    采用 MTT 法进行检测。取对数生长期的 HepG2、
              DMEM培养基（批号10-013-CVRC）购自美国Corning              SMMC-7721、Huh-7细胞，经胰酶消化后，调整细胞悬液
          公司；胎牛血清（批号 04-007-1A）购自以色列 Biological              浓度至 5×10 个/mL。将上述悬液按每孔 100 μL 接种
                                                                         4
          Industries 公司；MTT 试剂（批号 M8180）购自北京索莱               至 96 孔板中，培养至细胞贴壁后，分别加入含 SPS 的
          宝科技有限公司；Hoechst 33258染液、Beyo ECL Plus试             DMEM 培养基（SPS 浓度分别为 200、100、50、25、12.5、
          剂（批号分别为C1017、P0018S）均购自碧云天生物技术                     6.25、0 μmol/L，按前期预实验结果设置），每浓度设置 3
          有限公司；苏木精-伊红（HE）染液（批号 Top 0046）购自                   个复孔，并另设空白对照组（不加细胞与药物，只加培养
          北京博奥拓达科技有限公司；BCA 总蛋白定量测定盒                          基）。分别于培养 24、48、72 h 时，加入 5 mg/mL 的 MTT
         （批号 A045-4-2）购自南京建成生物工程研究所；AO 染                     溶液20 μL，继续培养4 h；弃去上清液，每孔加入二甲基


          中国药房  2022年第33卷第24期                                              China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 24    · 2963 ·
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