Page 31 - 《中国药房》2022年24期
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肝纤维化是由各种致病因子导致慢性肝损伤的病                          白 激 酶 B（protein  kinase  B，Akt）、磷 酸 化 Akt（p-Akt）
          理性修复过程，细胞外基质过度沉积是其主要病理特                           （Ser473）、波形蛋白（vimentin）克隆抗体（批号分别为
          征。肌成纤维细胞是产生细胞外基质的核心细胞，而肝                           10021367、10020148、10010984）均购自 Proteintech 中国
          细胞、肝星状细胞和胆管上皮细胞可通过上皮间质转化                           公司；兔源 E-钙黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗体（批号
         （epithelial mesenchymal transition，EMT）为肌成纤维细       AF06224214）购自北京博奥森生物技术有限公司；兔源
            [1]
          胞 。近年来研究发现，EMT可促进肝纤维化的发生发                          甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy‐
          展，但 EMT 过程是可逆的，抑制细胞 EMT 过程，能减缓                     drogenase，GAPDH）多克隆抗体（批号 GR3316865-11）
                              [2]
          甚至逆转肝纤维化进程 。这使得逆转 EMT 成为抗肝                         购自英国Abcam公司；水为蒸馏水。
          纤维化的潜在策略。                                          1.3 动物
              柠檬苦素是一种三萜类化合物，也是橙子和柠檬种                             SD 大鼠 42 只，SPF 级，雄性，体质量 180～220 g，购
          子以及果皮中的主要活性成分，具有保肝、抗肝癌、抗炎                          自辽宁长生生物技术股份有限公司，生产许可证号为
                    [3]
          等药理作用 。有研究表明，柠檬苦素可通过转化生长                           SCXK（辽）2020-0001。大鼠由贵州中医药大学实验动
          因子 β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1 ）/Smad 信
                                                             物中心喂养。大鼠自由饮水摄食，适应性喂养1周后开
          号通路来逆转博来霉素诱导的肺组织 EMT 过程，减轻                         始实验。本实验由贵州中医药大学动物实验伦理委员
                        [4]
          小鼠的肺纤维化 。为探究柠檬苦素对肝纤维化的改善                           会批准（批号20210008）。
          作用，以及其抗肝纤维化作用是否与调控EMT相关，本
                                                             2 方法
          研究以四氯化碳（CCl4 ）造模法构建肝纤维化大鼠模型，
                                                             2.1 动物分组、建模、给药及取材
          观察柠檬苦素对大鼠肝纤维化的影响，并基于 EMT 角
                                                                 将大鼠随机分成正常组、模型组、阳性对照组（秋水
          度，初步探讨其可能的作用机制，旨在为柠檬苦素的药
                                                                            [5]
                                                             仙碱 0.1 mg/kg） 和柠檬苦素低、高剂量组（12.5、50
          理研究与开发利用提供参考。
                                                                    [4]
                                                             mg/kg） ，正常组和模型组各9只，其余每组各8只。除
          1 材料
                                                             正常组大鼠腹腔注射橄榄油外，其余各组大鼠均腹腔注
          1.1 主要仪器
                                                             射含 50%CCl4的橄榄油混合溶液（体积比 1∶1），注射体
              本研究所用主要仪器有 DM500 型光学显微镜（德
                                                             积为1.5 mL/kg，每周2次，连续注射8周，构建肝纤维化
          国 Leica 公司）、TGL-20M 型台式高速冷冻离心机（长沙
                                                                 [6]
                                                             模型 。注射造模8周后，从正常组和模型组中各抽取1
          高新开发区湘仪贝克仪器仪表有限公司）、EPS-300型电
                                                             只大鼠处死并取出肝脏行苏木精-伊红（HE）染色，依据
          泳仪（上海天能科技有限公司）、RS-25S型超声波细胞粉
                                                                                        [7]
                                                             Scheuer 评分系统评估造模成功 。从第 9 周起，各组大
          碎机（宁波荣顺科技仪器厂）、EL10A 型自动酶标仪（博
                                                             鼠按 10 mL/kg 灌胃，正常组及模型组给予水，其余各组
          科控股集团有限公司）、Mini-PROTEAN Tetra Electro‐
                                                             大鼠给予相应药物（临用时用水溶解），每日1次，连续给
          phoresis System 型蛋白电泳槽和 Mini Trans-Blot 型蛋白
                                                             药 4 周。末次给药后（第 12 周末），大鼠禁食不禁水 12
          转印系统（美国Bio-Rad公司）、LIDE 200型扫描仪（日本
                                                             h，腹腔注射 3% 戊巴比妥钠麻醉后采血，离心后留取血
          Canon公司）等。
          1.2 主要药品与试剂                                        清，于－20 ℃保存，用于酶联免疫吸附测定；大鼠采血后
                                                             处死，将肝右叶组织用 4% 多聚甲醛溶液固定，用于 HE
              柠 檬 苦 素 对 照 品（批 号 NMKS2021081，纯 度
                                                             和Masson染色；剩余肝组织立即冻存在－80 ℃冰箱中，
          99.58%）购自南京春秋生物工程有限公司；秋水仙碱片
         （批号201202，规格0.5 mg）购自西双版纳版纳药业有限                     用于 Western blot 检测。整个实验期间，正常组和模型
          责任公司；CCl4 （批号20181008，纯度≥99.5%）购自天津                组大鼠无死亡，阳性对照组和柠檬苦素低、高剂量组各
          市大茂化学试剂厂；透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层                死亡1只大鼠，总计死亡3只大鼠。
          粘连蛋白（laminin，LN）试剂盒（货号分别为 RA20032/                 2.2 血清中肝功能指标和肝纤维化指标的检测
          20211010、RA20606/20211010）均购自武汉贝茵莱生物                   采用酶联免疫吸附测定法，按试剂盒说明书步骤操
          科技有限公司；丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，            作，检测各组大鼠血清中ALT、AST、HA、LN含量。
          ALT）、天 冬 氨 酸 转 氨 酶（aspartate  aminotransferase，    2.3 肝组织形态和肝纤维化的观察
          AST）试剂盒（批号分别为 20211015、20211016）均购自                    取“2.1”项下各组3只大鼠固定于4%多聚甲醛溶液
          南京建成生物工程研究所；ECL高灵敏度化学发光检测                          的肝组织，石蜡包埋、切片，每只大鼠取3个切片进行HE
          试剂盒、ECL低背景发光检测试剂盒和辣根过氧化物酶                          染色，另外取 3 个切片进行 Masson 染色，用光学显微镜
         （horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔及羊抗鼠免             观察肝组织形态和肝纤维化并采集图像，用 Image-Pro
          疫球蛋白 G 抗体（批号分别为 30330、50330、20330、                 Plus 6.0 软件测定 Masson 染色图像的光密度和面积，计
          30324）均购自江苏康为世纪生物科技有限公司；鼠源蛋                        算平均光密度。


          中国药房  2022年第33卷第24期                                              China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 24    · 2969 ·
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