Page 55 - 《中国药房》2022年23期

黄草乌为毛茛科植物黄乌头 Aconitum vilmorini‐ 有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒
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anum Kom. 的干燥块根 ，有剧毒，收载于 2005 年版《云 （批号 A003）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，
南省中药材标准》中。黄草乌具有祛风散寒、除湿止痛 SOD）检测试剂盒（批号 A001-3-2）、BCA 蛋白浓度检测
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的功效，临床用于治疗跌打损伤、风湿痛、手足厥冷等 。 试剂盒（批号 A045-4-2）均购自南京建成生物工程研究
乌头属植物对心脏有明显毒性，能诱发不同类型的心律 所；一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（批号 C1086）
失常。其含有的乌头属类生物碱是主要的毒性成分，其 购自上海碧云天生物技术有限公司；活性氧（reactive
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中以乌头碱最具代表性 。黄草乌同属乌头属植物，其 oxygen species，ROS）检测试剂盒（批号 C1051902）购自
生品中所含的双酯型二萜生物碱（如滇乌碱）与乌头碱 北京鼎国昌盛生物技术有限公司；兔源胱天蛋白酶 3
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的结构相似 。滇乌碱是黄草乌的主要活性成分之一， （caspase-3）多克隆抗体、兔源 caspase-9 多克隆抗体、兔
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但同时也是其主要毒性成分之一 。本课题组前期研究 源 B 淋巴细胞瘤 2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）单克隆抗
结果显示，黄草乌经炮制后对心脏的毒性明显降低，这 体、兔源 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体均
与黄草乌炮制后滇乌碱含量显著降低有关 [5―6] 。相关研 购自英国 Abcam 公司；兔源 Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 as‐
究表明，滇乌碱引起大鼠心律失常的毒性作用可能与其 sociated X protein，Bax）单克隆抗体购自沈阳万类生物
降低了心肌细胞线粒体能量代谢和引起了钙超载有 科技有限公司；山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG二
关 ；并且，滇乌碱还可抑制H9c2心肌细胞活性，破坏心 抗购自美国Bioworld公司；其他试剂均为分析纯或实验
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肌细胞膜的稳定性，诱导心肌细胞凋亡 。但关于滇乌 室常用规格。
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碱致大鼠心肌损伤与线粒体凋亡途径的相关性尚未明确。 1.3 动物
细胞凋亡又名细胞程序性死亡，是维持机体正常新 本研究所用的动物为SPF级SD大鼠，共40只，雌雄
陈代谢的一种正常的生理过程。心肌细胞为高度分化 各半，体质量 200～220 g，由广东省医学实验动物中心
的终末细胞，不具有再生能力，而过度凋亡可造成心肌 提供，动物生产合格证号为SCXK（粤）2018-0002。饲养
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细胞持续丧失，使心肌发生结构性病变 。现有研究表 环境温度为20～25 ℃，相对湿度为40%～70%。所有大
明，细胞凋亡的线粒体途径是指由于线粒体受到氧化应 鼠适应性喂养5 d后进行实验。该实验方案经广东药科
激、钙超载、DNA损伤等多种刺激启动凋亡程序，激活多 大学动物实验伦理委员会批准，批准号为 gdpulacspf-
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种转录因子而引起的细胞凋亡 。本文基于现有研究， 2017319。
通过线粒体途径探究滇乌碱导致大鼠心肌细胞凋亡的 2 方法
机制，从而揭示滇乌碱引起大鼠心肌损伤的可能毒性机 2.1 动物分组与给药
制，以期为黄草乌及其活性成分的临床安全使用提供实 将 40 只 SD 大鼠按随机数字表法随机分为正常组、
验依据。 滇乌碱高剂量组（0.14 mg/kg）、滇乌碱低剂量组（0.09
1 材料 mg/kg）和乌头碱组（阳性对照，0.88 mg/kg），每组10只。
1.1 主要仪器 正常组大鼠灌胃生理盐水，各给药组大鼠灌胃相应药
本研究所用的主要仪器有：VARIOSKAN 型多功能 液，灌胃体积均为 1 mL/100 g，每天灌胃 1 次，连续灌胃
微孔板读数仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]，Bio- 7 d。给药方案参照本课题组前期研究设置，滇乌碱高、
Rad 型 电 泳 仪 、电 转 系 统（Mini 型 蛋 白 电 泳 系 统）、 低剂量分别为大鼠的 1/4、1/6 半数致死量（median lethal
UV1300/1500型紫外-可见分光光度计[美析（中国）仪器 dose，LD50 ），乌头碱剂量为大鼠的1/10 LD50 。
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有限公司]，URIT-8021A型全自动生化分析仪（桂林优利 2.2 标本采集与处理
特医疗电子有限公司），LG2000型数码凝胶图像分析系 末次灌胃 1 h 后，将大鼠麻醉，腹主动脉取血 5 mL，
统（杭州朗基科学仪器有限公司），Infinite 200 PRO型多 将血液静置一段时间后，以 3 500 r/min 离心 10 min，分
功能荧光酶标仪（奥地利 Tecan Austria GmbH 公司）， 离血清。取血后，立即打开大鼠胸腔，用生理盐水灌注
BX51 型 荧 光 显 微 镜（日 本 Olympus 公 司），JEM400 心脏，取一部分左心耳心肌组织于 4% 多聚甲醛固定液
PLUS型电子透射显微镜（日本电子株式会社）。 中固定保存，另一部分左心耳心肌组织于 2.5% 戊二醛
1.2 主要药品与试剂 中固定保存；其余心肌组织于－80 ℃冻存备用。
滇乌碱对照品（批号 MUST1910，纯度≥98％）、乌 2.3 大鼠血清中LDH、CK、CK-MB水平检测
头碱对照品（批号MUST1911，纯度≥98％）均购自成都 取大鼠血清，分别按各试剂盒说明书步骤操作，使
曼斯特生物科技有限公司；肌酸激酶（creatine kinase， 用全自动生化分析仪检测大鼠血清中心肌酶学指标
CK）检测试剂盒（批号 25192028）、肌酸激酶同工酶 LDH、CK、CK-MB的水平。
（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）检测试剂盒（批号 2.4 大鼠血清中MDA含量和SOD活性检测
25192124）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检 取大鼠血清，按相应试剂盒说明书操作，使用紫外-
测试剂盒（批号 25191925）均购自桂林优利特医疗电子 可见分光光度法检测大鼠血清中MAD含量和SOD活性。

中国药房 2022年第33卷第23期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 23 · 2865 ·