Page 50 - 《中国药房》2022年23期
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醉，于腹主动脉采血，血样以3 000 r/min离心15 min，取                  BCA 法检测蛋白浓度。蛋白变性后使用十二烷基硫酸
          上层血清，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中肌酐                            钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，加入 SIRT3、FOXO3a、
         （creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）及       SOD2、GAPDH 一 抗（稀 释 度 分 别 为 1∶800、1∶800、
            2+
          Ca 含量。                                              1∶5 000、1∶800）封闭，4 ℃孵育过夜；洗膜，加入二抗（稀
          2.3 大鼠肾组织病理学形态观察                                    释度为 1∶5 000），室温孵育 30 min；采用 ECL 法曝光显
              采用 HE 染色法进行观察。大鼠采血完成后，采用                        色，经凝胶图像分析仪拍照后，采用 Image J 软件分析，
          空气栓塞法处死大鼠，然后剖取肾脏组织，取部分组织                            以目的蛋白条带与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值比值
          制备石蜡切片（剩余组织于液氮中保存备用，进行后续                            表示目的蛋白的表达水平。
          实验）：取肾脏组织适量以 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，经                     2.9 统计学方法
          梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度为                                采用 SPSS 25.0 统计学软件进行分析，数据以 x±s
          4 μm）等过程制作病理切片；切片经二甲苯脱蜡后，进行                         表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较使用
          HE染色，然后于显微镜下观察肾组织病理学变化。                             LSD-t检验。大鼠肾结晶评分时，组间比较采用Kruskal-
          2.4 大鼠草酸钙肾结晶情况观察                                    Wallis H检验。检验水准α＝0.05。
              采用Von Kossa染色法进行观察。将“2.3”项下剩余                   3 结果
          切片置于透明湿盒中，立即滴加 Von Kossa 染色液于组                      3.1 石淋清颗粒对大鼠24 h尿量和尿液中相关指标的
          织切片上，以紫外灯连续照射 5～20 min，蒸馏水清洗                        影响
          15 s×5次；以苏木素染色3～5 min，梯度乙二醇脱水，再                         与空白组比较，模型组大鼠 24 h 尿量和尿液 pH 值
          以伊红染色5 min；脱水封片，于显微镜下观察大鼠草酸                         均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），尿液中 Ca 、Ox 含量
                                                                                                    2+
          钙肾结晶情况。每只大鼠选取3张切片，每张切片选取                            均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，石淋清颗粒各剂
          3 个视野观察草酸钙肾结晶数目（取平均值），然后进行                          量组大鼠上述指标均显著逆转（P＜0.05或P＜0.01），而
          评分：0分为无结晶；1分为散在的结晶存在；2分为广泛                          SIRT3 抑制剂组大鼠上述指标差异无统计学意义（P＞
          分布但不成堆或局部结晶存在；3 分为成堆结晶但不连                           0.05）。结果见表2。
          接；4分为结晶成堆且连接；5分为广泛成堆结晶 。                            表2 各组大鼠24 h尿量和尿液中相关指标的检测结果
                                                   [10]
          2.5 大鼠肾组织超微结构观察                                         （x±s）
                                                                                                2+
              采用透射电子显微镜进行观察。取冻存的肾组织                           组别          n   24 h尿量/mL  pH值  Ca /（mmol/L）  Ox/mg
                                                              空白组         10  29.70±7.12  7.85±0.57  0.33±0.07  1.36±0.23
          适量，于 2.5% 戊二醛浸泡 4 h，以磷酸盐缓冲液漂洗
                                                              模型组         8   18.25±5.62 a  5.88±0.55 b  0.70±0.12 b  7.04±0.76 b
          15 min×4 次；再于 1% 锇酸中浸泡 1.5 h，以磷酸盐缓冲                 石淋清颗粒低剂量组   8   30.00±8.26 c  6.60±0.69 c  0.57±0.13 c  5.31±0.69 d
          液漂洗15 min×4次；经梯度乙醇脱水、浸透、包埋、切片                       石淋清颗粒中剂量组   10  31.40±9.58 d  6.64±0.77 c  0.55±0.13 c  4.79±0.72 d
                                                              石淋清颗粒高剂量组   8   41.00±5.86 d  6.70±0.69 d  0.53±0.16 c  4.61±0.95 d
          后，采用透射电子显微镜观察大鼠肾小球足突细胞中的
                                                              SIRT3抑制剂组   8   23.25±6.43  5.81±0.82  0.65±0.12  6.66±0.86
          线粒体、基膜及肾小管上皮细胞线粒体。                                     a：与空白组比较，P＜0.05；b：与空白组比较，P＜0.01；c：与模型组
          2.6 大鼠肾组织中MDA、SOD、ROS、OPN水平的检测                      比较，P＜0.05；d：与模型组比较，P＜0.01
              取适量冻存的肾组织进行匀浆，以3 000 r/min离心                    3.2 石淋清颗粒对大鼠血清中相关指标的影响
                                                                                                          2+
          15 min，取上清液，按照 MDA、SOD、ROS、OPN 试剂盒                      与空白组比较，模型组大鼠血清中Cr、BUN、Ca 含
          说明书方法操作，检测大鼠肾组织中上述指标水平。                             量均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，石淋清颗粒各
          2.7 大鼠肾组织中 SIRT3、FOXO3a、SOD2 mRNA 表                 剂量组大鼠血清中上述指标含量均显著逆转（低剂量组
                                                                2+
          达水平的检测                                              Ca 含量除外，P＜0.05 或 P＜0.01），而 SIRT3 抑制剂组
              采用PCR法进行检测。取冻存的肾组织100 mg于                       上述指标含量差异无统计学意义（P＞0.05）。结果
          匀浆管内，加入 RNA 提取液 1 mL 充分研磨后，提取总                      见表3。
          RNA。取总RNA进行反转录合成cDNA，再以cDNA为模                          表3 各组大鼠血清中相关指标检测结果（x±s）
                                                                                                     2+
          板进行PCR扩增。PCR扩增条件为95 ℃预变性10 min；                     组别             n    Cr/（μmol/L）  BUN/（mmol/L）  Ca /（mmol/L）
          95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 30 s，40 个循环。以 GAPDH              空白组           10    28.76±10.90  17.96±8.41  2.22±0.06
                                                              模型组            8    88.83±15.49 a  65.25±18.45 a  2.34±0.07 a
          为内参，采用2     －ΔΔCt 法计算目的基因mRNA的表达水平。                 石淋清颗粒低剂量组      8    63.67±13.71 c  47.18±16.14 b  2.29±0.05
          2.8 大鼠肾组织中SIRT3、FOXO3a、SOD2蛋白表达水                    石淋清颗粒中剂量组     10    68.30±18.15 c  48.39±19.42 b  2.26±0.05 c
                                                              石淋清颗粒高剂量组      8    60.63±20.64 c  40.05±13.82 c  2.28±0.04 b
          平的检测
                                                              SIRT3抑制剂组      8    83.11±11.85  60.82±13.50  2.30±0.06
              采用 Western blot 法进行检测。取冻存的肾组织适                     a：与空白组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组
          量，加入预冷的裂解液于冰上进行匀浆并离心，采用                             比较，P＜0.01


          · 2860 ·    China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 23                            中国药房  2022年第33卷第23期
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