Page 31 - 《中国药房》2022年23期
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益母草“行血养血，行血而不伤新血，养血而不滞疯血，                          产许可证号为 SCXK（湘）2019-0004，质量合格证号为
          诚为血家之圣药也”，其功在活血调经；三七为“止血之                          430727211100716136。购入后，将大鼠饲养于湖南中医
                                                       [6]
          神药”；仙鹤草能收敛止血；地榆炭、蒲黄炭凉血止血 。                         药大学实验动物中心，使用许可证号为SYXK（湘）2019-
                                                       [6]
          该产品在临床上用于治疗血热内扰证DUB安全有效 ，                          0009。本实验经湖南中医药大学实验动物伦理委员会
          但关于其作用机制的科学研究报道仍较为匮乏。表皮                            审查通过，伦理审查号为LLBH-202104080001。
          生长因子（epidermal growth factor，EGF）在子宫内膜修            2 方法
          复、诱导血管生成和止血中发挥着重要作用，其通过与                           2.1 动物分组、造模与给药
          细胞膜上的表皮生长因子受体（epidermal growth factor                  将 SD 大鼠按照雄雌数量 1∶2 的比例合笼 4 d，检查
                                      [7]
          receptor，EGFR）结合而发挥作用 。本研究拟通过建立                    雌性大鼠阴栓与阴道涂片，有精子时记为大鼠妊娠第 1
          大鼠 DUB 模型，探讨妇科断红饮胶囊通过 EGF-EGFR                     天 。选取妊娠大鼠18只，采用随机数字表法将其分为
                                                               [8]
          信号通路治疗 DUB 的作用机制，为进一步明确其作用                         空白对照组、模型对照组和妇科断红饮胶囊组，每组 6
          机制、推广其临床应用提供理论依据。                                  只。除空白对照组外，其余各组大鼠从妊娠第1天起，每
          1 材料                                               天 8：00 灌胃羟基脲片（450 mg/kg），并皮下注射氢化可
          1.1 主要仪器                                           的松（3.7 mg/kg），持续 7 d；妊娠第 8 天，每天 8：00 和
              本研究所用主要仪器有：K960型梯度PCR仪（杭州                      18：00分别灌胃米非司酮片（8.5 mg/kg）和米索前列醇片
          晶 格 科 学 仪 器 有 限 公 司），BioDrop  μlite+/BioDrop      （0.1 mg/kg），次日用棉签检测阴道出血情况，棉签上有
          DUO+型超微量核酸蛋白浓度检测仪（英国 BioDrop 公                     血迹说明 DUB 造模成功 。造模成功后第 1 天，妇科断
                                                                                  [9]
          司），T10BS25型全自动匀浆仪（德国IKA公司），ECO型
                                                             红饮胶囊组大鼠灌胃妇科断红饮胶囊 1.296 g/kg（临床
          PCR 扩增仪（美国 Illumina 公司），Universal Hood 11 型
                                                             等效剂量的4倍剂量），空白对照组和模型对照组大鼠灌
          Chemi Doc XRS+Imager 化学发光系统（美国 Bio-Rad 公
                                                             胃蒸馏水，灌胃体积均为10 mL/kg，每天1次，连续14 d。
          司），Axioimage A2 型正置显微镜（德国 Zeiss 公司），
                                                             2.2 一般状态和脏器指数检测
          TGL-16G型普通台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发                            造模及给药期间观察各组大鼠行为状态、毛发、二
          有限公司），ZL9100C型全自动凝血分析仪（北京众驰伟                       便、饮水饮食、出血等情况，称定大鼠体质量。末次灌胃
          业科技有限公司）。                                          1 h 后，麻醉大鼠，腹主动脉采血，置于含肝素钠的血液
          1.2 主要药品与试剂                                        采集管中，然后分离子宫和卵巢组织，称质量。将部分
              妇科断红饮胶囊（批号20200401，规格0.4 g）由株洲
                                                             组织置于多聚甲醛中保存用于病理分析，另一部分组织
          千金药业股份有限公司生产；醋酸氢化可的松片（批号
                                                             置于液氮中保存备用。计算大鼠卵巢指数和子宫指数：
          019200302，规格200 mg）购自上海上药信谊药厂有限公
                                                             卵巢指数（mg/g）＝卵巢质量（mg）/体质量（g），子宫指数
          司；羟基脲片（批号112038LC，规格0.5 g）购自齐鲁制药
                                                            （mg/g）＝子宫质量（mg）/体质量（g）。
          有限公司；米非司酮片（批号 140801，规格 25 mg）、米索
          前列醇片（批号 142816，规格 50 mg）均购自浙江仙琚制                   2.3 血液流变学指标检测
          药 股 份 有 限 公 司 ；超 纯 总 RNA 提 取 试 剂 盒（批 号                 取“2.2”项下血液，使用全自动凝血分析仪检测全血
          20211153）购自杭州新景生物试剂开发有限公司；反转                       高切相对指数、全血低切相对指数、红细胞聚集指数、卡
          录 试 剂 盒（批 号 05250410）、RT-qPCR 试 剂 盒（批 号            松黏度等血液流变学指标。
                                                             2.4 大鼠子宫和卵巢组织病理检测
          05238502）、鼠 源 β - 肌 动 蛋 白（β -actin）一 抗（批 号
          YM3028）购自安诺伦（北京）生物科技有限公司；兔源                            取充分固定的大鼠子宫和卵巢组织，石蜡包埋，以
          EGF 一 抗（批 号 PAB31668）、兔 源 EGFR 一 抗（批 号             5 μm 厚度连续切片，梯度乙醇脱水、浸蜡、水化、冲洗，
          PAB30732）均购自武汉华联科生物技术有限公司；辣根                       采用苏木精-伊红（HE）进行染色，完成后将切片固定于
          过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠 IgG 二抗（批号                        载玻片上，中性树脂封片，采用显微镜进行图像采集，观
          S00020）购自美国 Affinity 公司；HRP 标记的山羊抗兔                察各组大鼠子宫内膜及卵巢组织病理形态并拍照分析。
          IgG二抗（批号BS13278）购自南京巴傲得生物科技有限                      2.5 大鼠子宫组织中 EGF-EGFR 信号通路相关基因
          公司；PCR实验中EGF、EGFR、低氧诱导因子1（hypoxia-                 mRNA表达检测
          inducible factor 1α，HIF-1α）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1              采用RT-qPCR法进行检测。称取1 g冻存的子宫组
         （serine/threonine-protein kinase，AKT1）、甘油醛-3 磷酸     织，加入RNA提取液，冰上匀浆，提取组织中总RNA，检
          脱氢酶（GAPDH）引物由生工生物工程（上海）股份有限                        测其纯度。根据反转录试剂盒说明书步骤将RNA反转
          公司合成。                                              录成 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。具体
          1.3 动物                                             扩增条件为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃
              本研究所用动物为 SPF 级 SD 大鼠，雌性 30 只（体                 退火/延伸 30 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参，采用
          质量 250～300 g），雄性 15 只（体质量 350～400 g），均             2 －ΔΔCt 法分析 EGF、HIF-1α、EGFR、AKT1 mRNA 的相对
          购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生                            表达水平。引物序列及扩增产物大小见表1。


          中国药房  2022年第33卷第23期                                              China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 23    · 2841 ·
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