Page 27 - 《中国药房》2022年23期
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12 h 光照循环的环境中。饲养期间小鼠自由饮水和进                         死，广泛炎症细胞浸润 。
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          食，适应性喂养1周后进行实验。本实验经广东省医学                           2.4.4 肝组织中IL-6、TNF-α mRNA表达的检测 每组
          实验动物中心实验动物伦理委员会审查通过，动物实验                           随机取3只小鼠的肝组织作为实验样本，采用实时荧光
          伦理审批号为C202211-1。                                   定量 PCR 法进行检测。采用 Trizol 法提取肝组织中总
          2 方法                                               RNA，按照 Evo-M-MLV 反转录预混型试剂盒说明书步
          2.1 实验药物的制备                                        骤 将 RNA 反 转 录 成 cDNA。 以 cDNA 为 模 板 ，按 照
             （1）造模药的制备：取一定量的CCl4与橄榄油混合，                      SYBR Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒说明书步
          用涡旋振荡仪涡旋均匀，制备 0.2%CCl4-橄榄油溶液。                      骤进行 PCR 扩增。PCR 扩增条件如下：95 ℃预变性 10
         （2）胆南星混悬液的制备：取天南星饮片，粉碎，过八号                          min；95 ℃变性 20 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 45 个循环。
          筛。将天南星粉与牛胆汁按1∶4的质量比混合发酵至黑                          PCR 反应体系（共 10 μL）如下：cDNA 模板 2 μL，上、下
          色浸膏状，干燥后即得胆南星。将胆南星粉碎，过八号                           游引物各 0.3 μL，2×SYBR Green Pro Taq HS Premix
          筛，加0.5%羧甲基纤维素钠溶液混合溶解，备用。（3）联                       5 μL，无霉无菌水 2.4 μL。以 18S 为内参，采用 2          －ΔΔCt 方
          苯双酯滴丸混悬液的制备：将联苯双酯滴丸粉碎，加                            法计算目的基因mRNA的表达水平。
          0.5%羧甲基纤维素钠溶液混合溶解，备用。                              2.4.5 肝组织中 JAK2、STAT3、NF-κB p65 蛋白表达的
          2.2 动物分组、造模与给药                                     检测 每组随机取 3 只小鼠的肝组织作为实验样本，采
              将 50 只小鼠按体质量随机分为 5 组，分别为正常                     用Western blot法进行检测。采用RIPA法提取肝组织中
          组、模型组、阳性对照组（联苯双酯滴丸，150 mg/kg，为成                    总蛋白，按 BCA 蛋白定量试剂盒说明书操作检测总蛋
          人临床剂量的等效剂量）和胆南星低、高剂量组（0.78、                        白浓度。将总蛋白高温变性后，上样（上样量为 20 μL）
          2.34 g/kg，为成人临床剂量的 1、3 倍等效剂量），每组 10                8% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压 80～
          只。正常组和模型组小鼠灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶                          110 V，时间1.5 h），然后电转（恒流320 mA，时间3 h）至
          液，其余各组小鼠灌胃相应药液，灌胃体积均为 10                           PVDF 膜上，用 5% 脱脂奶粉封闭 2 h。以 TBST 洗膜 3
          mL/kg，每天灌胃1次，连续灌胃7 d。末次灌胃2 h后，除                    次，加入 STAT3、JAK2、NF-κB p65、GAPDH 一抗（稀释
          正常组外的其余各组小鼠均一次性腹腔注射0.2% CCl4-                      比例均为1∶2 000），4 ℃孵育过夜；用TBST洗膜3次，加
          橄榄油溶液（剂量为10 mL/kg）复制急性肝损伤模型，正                      入对应二抗（稀释比例均为 1∶2 000），室温孵育 1 h；用
          常组小鼠腹腔注射同等体积橄榄油 。                                  TBST 洗膜 3 次，加入 ECL 显影液进行显影，拍照记录。
                                        [8]
          2.3 动物取材                                           使用 Vision Works 软件检测条带灰度值，以目的蛋白与
              小鼠腹腔注射 0.2% CCl4-橄榄油溶液后，禁食不禁                   内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比值表示目的蛋白的
          水。腹腔注射 17 h 后，称定小鼠体质量，并摘取小鼠眼                       表达水平。
          球取血，将血液以 3 000 r/min 离心 10 min，分离血清，               2.5 统计学方法
          于－80 ℃冰箱中冻存，备用。取血后，将小鼠脱颈椎处                             采用 GraphPad Prism 7.0 软件对数据进行统计分
          死，取出其肝组织，仔细观察并拍照。称定肝质量，然后                          析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
          将一部分肝组织置于－80 ℃冰箱中冻存，另一部分肝组                         分析，组间两两比较采用LSD-t检验；病理分级统计数据
          织置于4%多聚甲醛中固定。                                      采用Mann-Whitney U检验。检验水准α＝0.05。
          2.4 指标检测                                           3 结果
          2.4.1 生化指标检测 按相应试剂盒说明书操作检测                         3.1 小鼠血清中ALT、AST水平检测结果
          小鼠血清中肝功能指标（ALT、AST）和炎症指标（IL-6、                         与正常组比较，模型组小鼠血清中 ALT、AST 水平
          TNF-α）水平及小鼠肝组织中氧化应激指标（MDA、                         均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠血
          SOD）水平。                                            清 中 ALT、AST 水 平 均 显 著 降 低（P＜0.05）。 结 果
          2.4.2 肝脏指数计算 通过取材前小鼠体质量和取材                         见表2。
          后小鼠的肝质量计算小鼠的肝脏指数：肝脏指数（%）＝                          表2 各组小鼠血清中 ALT、AST 水平检测结果（x±s，
          肝质量（g）/体质量（g）×100%。                                     n＝10，U/L）
          2.4.3 肝组织病理形态学观察 取4%多聚甲醛固定的                         组别                     ALT            AST
          肝组织适量，常规制备石蜡切片，进行 HE 染色后，在光                         正常组                   16.37±3.18     27.87±4.52
                                                              模型组                  151.29±31.16 a  111.45±16.17 a
          学显微镜下观察肝组织的形态变化并对肝损伤程度进
                                                              阳性对照组                 18.70±4.31 b   49.28±19.31 b
          行量化评分。评分标准如下：0级（0分）——正常肝组织                          胆南星低剂量组               53.27±17.82 b  62.31±15.51 b
          细胞；Ⅰ级（1分）——肝细胞轻微肿胀，散发炎症细胞浸                          胆南星高剂量组               18.67±4.77 b   33.70±10.34 b
          润，个别肝细胞坏死；Ⅱ级（2 分）——肝小叶不超过 1/3                         a：与正常组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
          的局灶或斑块性肝细胞坏死，聚集性炎症细胞浸润；Ⅲ                           3.2 小鼠血清中IL-6、TNF-α水平检测结果
          级（3 分）——肝小叶 1/3～1/2 的肝细胞坏死，大量炎症                        与正常组比较，模型组小鼠血清中 IL-6、TNF-α 水
          细胞浸润；Ⅳ级（4 分）——肝小叶超过 1/2 的肝细胞坏                      平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠


          中国药房  2022年第33卷第23期                                              China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 23    · 2837 ·
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