Page 19 - 《中国药房》2022年22期
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effect against OGD/R-induced neuronal injury， possibly through mitochondria targeting therapy.
          KEYWORDS    Gastrodia elata； brain mitochondria； ultrafil-tration centrifutgation； HPLC； targeted therapy； neuroprotec-tion


              线粒体在维持大脑活动中发挥着重要作用，不仅是                         度≥98%）、噻唑蓝（MTT）（批号 823L051）、线粒体提取
          神经细胞的主要能量来源，还参与神经细胞凋亡、产生                           试剂盒（批号 SM0020）均购自北京索莱宝科技有限公
          活性氧（reactive oxygen species，ROS）、调节能量代谢和           司；中性红（批号 DS300-2）购自北京鼎国昌盛生物技术
                              [1]
          维持钙平衡等生理调节 。线粒体功能障碍会导致许多                           有限责任公司；健那绿（批号 S19083-5g）购自上海源叶
          神经类疾病，如：脑缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、亨                          生物科技有限公司；线粒体膜电位（mitochondrial mem‐
                            [2]
          廷顿病和帕金森病等 。因此，针对线粒体功能障碍，防                          brane potential，MMP）检测试剂盒 JC-1（批号 BL711A）、
          止线粒体损伤对治疗神经类疾病具有重要意义。                              ROS 检测试剂盒（批号 S0033S）、线粒体通透性转换孔
              近年来，从中药中获取具有线粒体靶向功能的活性                        （mitochondrial permeability transition pore，MPTP）检测
                            [3]
          成分已成为研究热点 。天麻为兰科植物天麻 Gastro‐                       试剂盒（批号 C2009S）、乳酸脱氢酶（lactate dehydroge‐
          dia elata Bl.的干燥块茎，具有抗氧化应激、抗衰老、改善                  nase，LDH）细胞毒性检测试剂盒（批号C0016）均购自上
          记忆障碍、抗抑郁等药理作用，用于治疗帕金森病、阿尔                          海碧云天生物技术有限公司；腺苷三磷酸（adenosine tri‐
          茨海默病、癫痫、抑郁症、脑缺血损伤等疾病 。目前，在                         phosphate，ATP）含量测试盒（批号 A095-2-1）购自南京
                                               [4]
          天麻中发现了近百种化合物，包括酚类（如天麻素、对羟                          建成生物工程研究所。
          基苯甲醇）、有机酸类（如巴利森苷）、甾体类（如 β-谷甾                       1.3 实验动物和细胞株
               [5]
          醇）等 。实验研究表明，天麻素、巴利森苷等可发挥抗                              20只SPF级雄性SD大鼠，体质量为250～280 g，购
                                                 [6]
          氧应激、抑制细胞凋亡、保护神经细胞的作用 。然而，                          自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证
          对天麻改善线粒体功能的活性成分尚未确定，这严重限                           号 SCXK（湘）2019-0004。所有涉及动物的程序均符合
          制了其神经保护机制的进一步研究。                                  《医学实验动物管理实施细则》的要求，伦理审查编号为
              近年来，有研究者基于超滤离心和高效液相色谱                          R-062021088。HT22 海马神经元细胞购自上海酶研生
                                                             物科技有限公司。
         （HPLC）-质谱联用的方法获取靶向肝脏、心脏中线粒体
          的中药活性成分，并通过药理实验证明所获取成分具有                           2 方法与结果
          活性作用    [7―8] ，这是从复杂成分中高效获取线粒体靶向                   2.1 大鼠脑组织中线粒体的提取及其纯度、活性评估
          化合物的有效方法。基于天麻中主要成分已基本被鉴                            2.1.1 线粒体的提取 脱颈处死 SD 大鼠，快速取出大
          定，本课题组利用超滤离心选择性分离与脑线粒体结合                           脑，置于预冷的生理盐水中（手术均于冰上进行）。根据
          的天麻成分，并采用HPLC法分析鉴定；最后，通过缺氧                         线粒体提取试剂盒说明书提取脑线粒体，得纯化线
          缺 糖/复 氧（oxygen-glucose  deprivation/reoxygenation，  粒体。
                                                             2.1.2 线粒体纯度评估 将纯化线粒体与非纯化线粒
          OGD/R）细胞实验研究所得化合物的神经保护活性。
          1 材料                                               体（未经线粒体提取试剂盒中 Wash Buffer 处理的线粒
                                                             体，含有其他细胞组织）分别悬浮于200 μL磷酸盐缓冲
          1.1 主要仪器
                                                             溶液中，并加入 0.3% 健那绿溶液（线粒体专属染料）和
              本研究所用主要仪器有 DMi1 型倒置生物显微镜
                                                             0.15%中性红溶液（溶酶体、高尔基体染色）各100 μL混
         （上海徕卡仪器有限公司）、FD-1A-50型冷冻干燥机（北
                                                             合。在室温下培养 10 min 后，置于显微镜下观察 。结
                                                                                                       [7]
          京博医康实验仪器有限公司）、VariosKan型全波长扫描
                                                             果显示，非纯化线粒体中可见大量的杂色，纯化线粒体
          式多功能酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]、
                                                             则 为 单 一 的 蓝 绿 色 ，表 明 经 提 取 的 线 粒 体 纯 度
          1260型HPLC仪（美国Agilent公司）、ST60-4型微孔板恒
                                                             高（图1）。
          温振荡器（杭州米欧仪器有限公司）等。
          1.2 主要药品与试剂
              天麻粉由云南省傣医药与彝医药重点实验室提供，
          经云南省傣医药与彝医药重点实验室尹子丽副教授鉴
          定为兰科植物天麻 G. elata Bl. 的干燥块茎粉末。对照
          品对羟基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol，HBA）、对羟
          基苯甲醛（p-hydroxybenzaldehyde，HBD）、尼莫地平、阿
          莫 西 林（ 批 号 分 别 为 AF21030253、AF20062752、
          AF21052851、AF21052807）均购自成都埃法生物科技有                        A.非纯化线粒体                 B.纯化线粒体
          限公司，纯度均不小于 98%；阿司匹林对照品（批号                          图1 非纯化线粒体、纯化线粒体的健那绿和中性红染
          A8830，纯度≥98%）、依达拉奉对照品（批号 IE0020，纯                       色图（×400）


          中国药房  2022年第33卷第22期                                              China Pharmacy  2022 Vol. 33  No. 22    · 2701 ·
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