Page 20 - 《中国药房》2022年22期

2.1.3 线粒体活性评估 将实验分为对照组和羰基氰 表1 流动相梯度洗脱程序
化物间氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydra‐ 时间/min A/% B/% 时间/min A/% B/%
zone，CCCP）处理组（CCCP 可诱导膜电位下降），每组 0 0 100 15 100 0
12 100 0 18 0 100
设置 4 个平行。每组取 200 μL 纯化线粒体悬浮液（1
2.2.3 实验验证 取“2.2.1（3）～（7）”项下溶液，按
mg/mL，磷酸盐缓冲溶液配制，下同），对照组用常规细
胞培养液处理，CCCP 处理组用含 CCCP 的细胞培养液 “2.2.2”项下色谱条件进样分析。当对照组和实验组的
（1∶1 000）处理，根据MMP检测试剂盒JC-1说明书检测 峰面积之差与对照组峰面积的比值（ΔP）＞20%时，表明
[7]
线粒体活性。采用全波长扫描式多功能酶标仪在激发 成分与线粒体能特异性结合 。ΔP 值计算公式如下：
波长为525 nm、发射波长为590 nm时测定荧光值，荧光 ΔP＝（Pe－Pc ）/Pe×100%，其中Pe、Pc分别代表对照组、实
值越大，MMP 越高。实验数据使用 Graphpad Prism 9.0 验组的峰面积。由图2可知，与实验组混合标准溶液相
软件进行统计分析。实验数据以x±s表示，组间比较采 比，对照组混合标准溶液中尼莫地平峰面积有明显增
用 t 检验，检验水准 α＝0.05。结果显示，与对照组荧光 加，ΔP 为（34.11±1.10）%（＞20%），而阿司匹林和阿莫
值（154.90±4.05）相比，CCCP 处理组荧光值（80.10±
西林均未能被检测出（ΔP＜20%）。此外，结果显示，与
4.04）显著降低（P＜0.05），表明纯化线粒体具有活性。
实验组尼莫地平标准溶液相比，对照组尼莫地平标准溶
2.2 天麻中脑线粒体靶向化合物的获取方法可行性
液中尼莫地平峰面积有明显增加，ΔP为（43.41±6.06）%
验证
（＞20%）。有研究表明，阿莫西林和阿司匹林不与线粒
采用超滤离心-HPLC 法进行测定。以纯化线粒体
[11]
体结合 [9―10] ，尼莫地平可与线粒体特异性结合 。因此，
为对照组；取纯化线粒体在沸水中持续加热2 h，产生失
上述结果表明超滤离心-HPLC法具有识别分离功能，可
去主要生物学功能的失活线粒体，将其作为实验组。
用于获取具有线粒体靶向功能的化合物。
2.2.1 溶液的制备 （1）混合标准溶液：参考文献[7]，采
500 尼莫地平
用二甲基亚砜制备阿司匹林、尼莫地平、阿莫西林质量 400
浓度均为2 mg/mL的混合标准溶液。（2）尼莫地平标准溶 mAU 300
200
100
液：采用二甲基亚砜制备尼莫地平质量浓度为2 mg/mL 0
的标准溶液。（3）实验组混合标准溶液：精密吸取5 μL混 0 2 4 6 8 10 12 14 16
t/min
合标准溶液与 200 μL 失活线粒体悬浮液（1 mg/mL，磷 A.对照组混合标准溶液
酸盐缓冲溶液配制，下同），在 37 ℃条件下孵育 60 min 400 尼莫地平
300
（化合物与线粒体特异性结合）；孵育后置于 0.5 mL 10 mAU 200
kDa 超滤管中，在 4 ℃下以 14 000 r/min 离心 25 min（去 100 0
除未结合成分）后用乙酸铵缓冲液（50 mmol/L，pH7.5） 0 2 4 6 8 10 12 14 16
t/min
冲洗 3 次，每次 200 μL（清洗未结合成分）；于超滤管中 B.实验组混合标准溶液
加入400 μL 80%甲醇超声（频率500 W，功率40 kHz，下 500 尼莫地平
400
同）20 min后，在室温下以14 000 r/min离心25 min（分离 mAU 300
200
结合成分），即得超滤液。将超滤液置于氮气气流下干 100 0
燥，用 100 μL 80% 甲醇溶解后即得实验组混合标准溶 0 2 4 6 8 10 12 14 16
t/min
液 。（4）对照组混合标准溶液：精密吸取5 μL混合标准 C.对照组尼莫地平标准溶液
[7]
溶液与 200 μL 纯化线粒体悬浮液，按“2.2.1（3）”项下方 200 尼莫地平
150
法制备，即得。（5）实验组尼莫地平标准溶液：精密吸取 mAU 100
5 μL 尼莫地平标准溶液与 200 μL 失活线粒体悬浮液， 50 0
按“2.2.1（3）”项下方法制备，即得。（6）对照组尼莫地平 0 2 4 6 8 10 12 14 16
t/min
标准溶液：精密吸取 5 μL 尼莫地平标准溶液与 200 μL D.实验组尼莫地平标准溶液
纯化线粒体悬浮液，按“2.2.1（3）”项下方法制备，即得。 1 500 尼莫地平
（7）尼莫地平对照品溶液：采用 80% 甲醇制成质量浓度 mAU 1 000
为1 mg/mL的尼莫地平对照品溶液。 500 0
2.2.2 色谱条件 以 Agilent SB-C18 （250 mm×4.6 mm， 0 2 4 6 8 10 12 14 16
t/min
5 μm）为色谱柱；水（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱程 E.尼莫地平对照品溶液
序见表 1；柱温为 30 ℃；检测波长为 230 nm；流速为 1 图2 天麻中脑线粒体靶向化合物的获取方法实验验证
mL/min；进样量为10 μL。 HPLC图

· 2702 · China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 22 中国药房 2022年第33卷第22期