Page 22 - 《中国药房》2022年22期
P. 22
2.5.2 HBA 对 OGD/R 损伤 HT22 细胞死亡率与形态学 使用酶标仪于激发波长 488 nm、发射波长 525 nm 处检
的影响 取对数生长期的HT22细胞接种于6孔板，细胞 测。结果显示，与对照组相比，模型组细胞中 ATP 水平
4
密度为6.4×10 个/mL，每孔2 mL，将细胞分为对照组、模 显著降低、ROS 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相
[12]
型组、阳性对照组（依达拉奉100 μmol/L ）和不同浓度 比，阳性对照组和不同浓度 HBA 组 ATP 水平（除 HBA
HBA（25、50、100 μmol/L）组，每组设置3个复孔，并设置 25 μmol/L组外）均显著升高、ROS水平均显著降低（P＜
细胞最大酶活性孔（对照组中正常培养细胞加入试剂盒 0.05）。结果见表4。
提供的 LDH 释放剂）。HBA 组与阳性组细胞加入含相 表4 各组细胞ATP、ROS水平比较（x±s，n＝5）
应浓度药物的完全培养基，对照组加入完全培养基。24 组别 ATP ROS 组别 ATP ROS
h 后，对照组更换新鲜完全培养基，其余各组加入含 10 对照组 288 996±3 894 2.93±0.02 HBA25 μmol/L组 113 991±3 091 8.98±0.12 b
模型组 115 843±2 410 a 10.20±0.33 a HBA50 μmol/L组 181 939±5 081 b 8.23±0.09 b
mmol/L 连二亚硫酸钠（Na2S2O4，常用细胞缺氧诱导剂） 阳性对照组 155 414±1 992 b 3.72±0.07 b HBA100 μmol/L组 142 537±1 742 b 6.22±0.08 b
[13]
的无糖培养基处理细胞 2 h 进行氧糖剥夺 ，随后更换 a：与对照组相比，P＜0.05；b：与模型组相比，P＜0.05
为 DMEM 高糖培养基复氧 2 h 建立 OGD/R 细胞模型。 2.5.4 HBA 对 OGD/R 损伤 HT22 细胞线粒体功能的影
细胞死亡率的检测根据LDH检测试剂盒说明书使用酶 响 按“2.5.2”项下方法进行细胞分组及处理，每组设置
标仪于 490 nm 波长下检测 A，计算细胞死亡率：细胞死 5 个复孔。参照 MPTP 检测试剂盒使用说明书操作，使
亡 率（%）＝（A 给药组 －A 对照组）/（A 细胞最大酶活性孔 －A 对照组）× 用酶标仪以激发光波长 494 nm、发射光波长 517 nm 进
100%。在实验过程中使用倒置显微镜观察各组 HT22 行检测，评估 MPTP 开放程度，荧光越强，开放程度越
细胞的形态并拍摄图片。结果显示，模型组细胞死亡率 低。参照“2.1.3”项下方法检测 MMP。结果显示，与对
为（16.66±1.57）%，阳性对照组和不同浓度HBA（25、50、 照组相比，模型组细胞中MMP水平显著降低，MPTP开
100 μmol/L）组的细胞死亡率均显著低于模型组（P＜ 放程度显著变大（P＜0.05）；与模型组相比，阳性对照组
0.05），并呈现剂量依赖性，细胞死亡率分别为（3.34± 和不同浓度 HBA 组 MMP 水平显著升高，MPTP 开放程
0.29）% 、（12.79±0.57）% 、（10.22±0.17）% 、（4.39± 度（除 HBA25 μmol/L 组外）显著降低（P＜0.05）。结果
0.24）%，其中 100 μmol/L HBA 保护作用最佳。细胞形 见表5。
态学观察如图4所示，模型组出现大量细胞皱缩，细胞突 表5 各组细胞MMP、MPTP比较（x±s，n＝5）
起减少，胞质凝聚；与模型组比较，HBA组细胞的形态得 组别 MMP MPTP荧光值 组别 MMP MPTP荧光值
对照组 14.82±0.52 258.4±13.03 HBA25 μmol/L组 5.22±0.08 b 139.8±10.54
到改善并呈现剂量依赖性。
模型组 3.60±0.06 a 127.8±10.33 a HBA50 μmol/L组 9.60±0.25 b 169.4±4.40 b
阳性对照组 10.95±0.22 b 225.4±13.92 b HBA100 μmol/L组 10.40±0.21 b 194.2±15.43 b
a：与对照组相比，P＜0.05；b：与模型组相比，P＜0.05
3 讨论
基于超滤离心-HPLC 法获取线粒体靶向化合物的
关键是获得大量具有活性和高纯度的线粒体。本研究
A.对照组 B.模型组
采取线粒体提取试剂盒提取高纯度线粒体，用线粒体专
[14]
属染料健那绿与中性红评估线粒体纯度 。采用CCCP
[15]
处理、检测 MMP 的方法来确定线粒体活性 。结果显
示提取的线粒体纯度高、活性强，可以用于进一步研究。
本研究采用阿莫西林、阿司匹林、尼莫地平3种成分
混合标准溶液，来检验超滤离心-HPLC法获取线粒体靶
C.阳性对照组 D. HBA 25 μmol/L组
向化合物的可行性。实验结果显示，3 种成分混合标准
溶液中尼莫地平对照组峰面积显著增强，而阿司匹林和
阿莫西林条件下均未见对照组峰面积增强。且进一步
通过尼莫地平标准溶液结合线粒体，结果与混合标准溶
液结果一致，尼莫地平对照组峰面积显著增强，表明超
E. HBA 50 μmol/L组 F. HBA 100 μmol/L组 滤离心-HPLC法具有分离和识别能力，可用于获取线粒
图 4 HBA 对 OGD/R 损伤 HT22 细胞形态影响的显微 体靶向化合物。
图（×400） 线粒体质量浓度、样品质量浓度和孵育时间是影响
2.5.3 HBA对OGD/R损伤HT22细胞ATP、ROS水平的 本研究的关键因素。首先，实验的灵敏度由线粒体质量
影响 按“2.5.2”项下方法进行细胞分组及处理，每组设 浓度决定，质量浓度越高，灵敏度越高，但当线粒体质量
[7]
置 5 个复孔。根据试剂盒说明书，测定 ATP、ROS 水平， 浓度大于 1.0 g/L 会堵塞超滤膜 。所以本研究选择 1.0
· 2704 · China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 22 中国药房 2022年第33卷第22期
