Page 21 - 《中国药房》2022年22期

2.3 天麻中脑线粒体靶向化合物的获取 300 P2
2.3.1 天麻冻干粉的制备 将 50 g 天麻粉浸入 500 mL mAU 200 P1 P3 P4
100
0
70%甲醇中30 min后，超声提取60 min，过滤提取液；残 0 2 4 6 8 10 12 14 16
余物加入 400 mL 70% 甲醇超声提取 60 min，过滤提取 t/min
A.线粒体超滤液（质量浓度600 g/L、孵育时间60 min）
液。将 2 次过滤的提取液通过旋转蒸发器在 45 ˚C 下减
压浓缩，浓缩物用冷冻干燥机冻干，即得天麻冻干粉，于 mAU 200 对羟基苯甲醇
100
室温下储存在干燥器中备用。 50 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
2.3.2 单因素实验筛选化合物获取的最佳条件 参考 t/min
“2.2”项下实验分组和“2.2.1（3）”项下对照组混合标准溶 B. HBA对照品溶液
400
液制备的方法，以天麻冻干粉的3个质量浓度（150、300、 mAU 300 对羟基苯甲醛
200
600 g/L）标准溶液，孵育时间为 60 min 进行操作，按 100 0
“2.2.2”项下色谱条件进样分析，每组平行测定3次，考察 0 2 4 6 8 10 12 14 16
t/min
标准溶液的最佳浓度。结果显示，质量浓度为 300、600 C. HBD对照品溶液
g/L 时，天麻提取物有 4 个峰 ΔP＞20%，但质量浓度为 图3 天麻中线粒体靶向化合物指认的HPLC图
600 g/L 时与线粒体结合的成分含量更高（表 2）。进一
诱导组MMP显著降低（P＜0.05）；与CCCP诱导组比较，
步以该质量浓度为标准溶液对孵育时间（30、60、90 min） HBA、HBD 处 理 组 MMP 显 著 升 高（P＜0.05），表 明
进行检测，考察标准溶液的最佳孵育时间。结果显示， HBA、HBD 处理均能使线粒体活性升高。此外，由表 3
孵育时间为 60 min 时，孵育效果最好，有 4 个峰 ΔP＞ 可知，HBA 改善 MMP 的作用优于 HBD，而且 2020 年版
20%（表2）。天麻中线粒体靶向化合物获取的最佳条件 《中国药典》中把 HBA 列入天麻质量控制的成分之一，
为：天麻冻干粉质量浓度600 g/L，孵育时间60 min。 因此选取HBA进行后续实验。
表2 不同质量浓度、不同孵育时间下天麻中成分与线 表3 获得化合物对MMP的影响（x±s，n＝6）
粒体结合效果（n＝3） 组别 化合物浓度/（μmol/L） MMP 组别 化合物浓度/（μmol/L） MMP
与线粒体结合成分的ΔP（x±s） 对照组 12.49±0.58 HBD处理组 50 9.42±0.40 b
影响因素 结合成分数量/个
P1 P2 P3 P4 CCCP诱导组 5.76±0.47 a 100 9.60±0.61 b
质量浓度150 g/L 32.33±5.18 33.67±1.86 2 HBA处理组 50 10.77±0.60 b 150 10.13±0.59 b
质量浓度300 g/L 34.69±4.42 40.51±3.52 39.97±7.67 28.81±6.67 4 100 11.01±0.49 b
质量浓度600 g/L 45.40±7.06 61.01±7.60 57.26±7.29 39.34±4.33 4 150 10.27±0.86 b
孵育时间30 min 23.24±1.93 33.54±4.23 2 a：与对照组比较，P＜0.05；b：与CCCP诱导组比较，P＜0.05
孵育时间60 min 40.49±8.91 52.41±2.50 57.20±8.07 35.74±5.59 4
孵育时间90 min 38.81±8.48 58.37±7.35 54.31±13.35 3 2.5 HBA对HT22细胞的神经保护作用
2.5.1 HT22 细胞存活率的检测 采用 MTT 法进行检
2.3.3 成分指认 取HBA、HBD对照品适量，分别采用
测。取对数生长期的HT22细胞接种于96孔板，细胞密
80% 甲醇制成质量浓度为 0.1 mg/mL 的对照品溶液，按
度为1×10 个/mL，每孔100 μL，将细胞分为空白对照组
5
“2.2.2”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。将上述色
（只加培养基，不加细胞）、正常组（正常培养细胞）、不同
谱图与“2.3.2”项下天麻冻干粉质量浓度为600 g/L、孵育
浓度 HBA（25、50、100、200、400 μmol/L）组，每组设置 6
时间为 60 min 时的实验组线粒体超滤液色谱图进行比
个复孔。HBA 组细胞加入含相应浓度药物的完全培养
对，指认P2为HBA、P3为HBD，结果见图3。
基（即含 10% 胎牛血清及 1% 青链霉素双抗的 RPMI
2.4 获得化合物对离体脑线粒体活性的影响
1640 培养基，下同），正常组加入完全培养基，于 37 ℃、
2.4.1 统计学方法 应用 Graphpad Prism 9.0 软件对数
5% CO2条件下培养24 h。使用酶标仪于490 nm波长处
据进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采
测定吸光度（A），计算各组细胞存活率：细胞存活率
用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验（方差
（%）＝（AHBA组－A 空白对照组）/（A 正常组－A 空白对照组）×100%。按
齐）或非参数秩和检验（方差不齐）。检验水准α＝0.05。 “2.4.1”项下统计方法计算（下同），结果显示，与正常组
2.4.2 MMP 测定 MMP 下降是线粒体活性下降的标 相比，HBA 给药浓度在 25～200 μmol/L 时，细胞存活率
志 。将纯化线粒体分为对照组（仅纯化线粒体）、CCCP 无 显 著 改 变（P＞0.05），分 别 为（103.70±4.68）% 、
[7]
诱导组、HBA处理组（CCCP+HBA 50、100、150 μmol/L）、 （99.05±3.66）%、（99.39±5.19）%、（94.50±2.12）%；给
HBD处理组（CCCP+HBD 50、100、150 μmol/L），每组设 药浓度为 400 μmol/L 时，细胞存活率[（90.49±2.58）%]
置 6 个平行。除对照组外，各组按“2.1.3”项下 CCCP 处 显著下降（P＜0.05）。可见 HBA 给药浓度在 25、50、100
理组方法处理并给予相应药物后，按“2.1.3”项下方法进 μmol/L时对细胞存活率影响较小，故选择上述浓度用于
行 MMP 检测。结果（表 3）显示，与对照组比较，CCCP 后续实验。

中国药房 2022年第33卷第22期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 22 · 2703 ·