Page 46 - 《中国药房》2022年21期
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照品（每个浓度 3 份）并依法测定，结果 80%、100%、                              100
          120% 加样量样品的平均加样回收率分别为 98.51%、                               80
          100.59%、98.76%，RSD分别为0.66%、0.51%、0.43%（n＝                   60                            CLT-AN
                                                                                                    CLT
          3），表明该方法准确度较好。                                             累积释放量/%  40
          2.5 包封率及载药量测定
                                                                      20
              取 0.2 mL 按最佳处方工艺制备的新鲜 CLT-AN，过
                                                                       0
          G50葡聚糖凝胶柱分离CLT-AN和游离CLT。分离出的                                  0     20    40     60    80
                                                                                    时间/h
          CLT-AN用甲醇超声10 min破乳，然后以13 000 r/min离
                                                               图3 CLT和CLT-AN的体外释药曲线（x±s，n＝3）
          心10 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤，取滤液10 μL，
          按“2.4”项下方法测定CLT-AN中包载的CLT含量（W e ）。                  2.8 抗RA的药效评价
          另取未过凝胶柱的样品 0.2 mL，直接用甲醇破乳，然后                        2.8.1  模型建立及分组、给药           于 SD 大鼠尾根部皮下
          以13 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm滤膜过               注射100 μL完全弗氏佐剂（含结核分枝杆菌10 mg/mL）
          滤，同法测定体系中药物总含量（Wt ）。通过下式计算包                         建立佐剂诱导关节炎（adjuvant induced arthritis，AIA）大
                                                                    [11]
                                       [15]
          封率：包封率（%）＝W e/Wt×100% 。另取 0.2 mL 按最                 鼠模型 ，造模当天记为第 0 天。造模后第 14 天，大鼠
          佳处方工艺制备的新鲜 CLT-AN，冻干后称定 CLT-AN                      四肢出现明显肿胀，提示造模成功。将AIA模型大鼠按
          干粉的总质量（Wd ），通过下式计算载药量：载药量                           随机数字表法分为模型组、CLT 组和 CLT-AN 组，每组 6
                           [16]
         （%）＝W e/Wd×100% 。各实验平行制备3份样品，每份                      只。按“2.4”项下方法测定游离CLT溶液浓度以及CLT-
                                                              AN溶液中CLT浓度后，CLT组和CLT-AN组大鼠分别尾
          样品测定 3 次。结果显示，CLT-AN 的包封率和载药量
                                                                                                       [10]
                                                              静脉注射给药，给药剂量按 CLT 计均为 1 mg/kg ；模型
          分别为（94.61±0.46）%和（2.42±0.21）%。
                                                              组大鼠同法注射等体积PBS。隔天注射1次，连续给药4
          2.6  体外稳定性考察
                                                              次。另外选取6只健康大鼠作为正常组，同法注射等体
              将按最优工艺制备的 CLT-AN 保存于室温条件下，
                                                              积PBS。
          分别在 0、1、3、5 d 定时取样测定其粒径、PDI、Zeta 电位
                                                              2.8.2  CLT-AN对AIA模型大鼠关节肿胀的影响               造模
          和包封率，考察其稳定性。每个时间点平行测定 3 次。
                                                              后第 14 天，参照文献[11]，采用 0～4 级关节评分法对各
          结果，随着放置时间的延长，CLT-AN 的粒径、PDI、Zeta
                                                              组大鼠关节肿胀程度进行评分：0分，无红斑和关节肿胀
          电位和包封率均无明显变化，且未见沉淀或浑浊现象，
                                                              迹象；1分，踝关节或脚掌中部有红斑或轻度肿胀；2分，
          说明 CLT-AN 在室温条件下贮存 5 d 比较稳定。结果
                                                              踝关节至脚掌中部有红斑和肿胀；3分，踝关节和足跖关
          见表4。
                                                              节有红斑和中度肿胀；4分，踝关节至脚掌有红斑和严重
           表4 室温下CLT-AN的稳定性考察结果（x±s，n＝3）
                                                              肿胀。关节肿胀度评分为四肢评分总和，用关节炎指数
           时间/d     粒径/nm      PDI     Zeta电位/mV  包封率/%
           0        95.8±1.3  0.180±0.010  －19.6±2.1  94.59±0.39  （arthritis index，AI）表示。另外使用测厚仪测定各组大
           1        94.7±1.0  0.187±0.020  －20.1±1.0  95.61±0.46  鼠后肢的脚掌厚度。AI 和脚掌厚度的测量从造模后第
           3        96.1±1.1  0.178±0.030  －21.3±2.0  93.77±0.63  14 天开始，每隔 1 天测定 1 次，直至造模后第 22 天。采
           5        96.8±1.5  0.184±0.010  －20.6±1.7  93.61±1.16
                                                              用SPSS 22.0软件进行统计学分析；数据以x±s表示，多
          2.7  体外释放行为考察                                       组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD
              精密量取 2.0 mL CLT 溶液（取 CLT 对照品，以二甲                检验；检验水准α＝0.05。结果见图4、图5。
          基亚砜为溶剂制得）和按最优工艺制备的 CLT-AN 溶液                            由图4可知，随着给药次数的增加，CLT-AN组大鼠
         （CLT 含量均为 1.18 mg），装入透析袋（截留分子量为                      的 AI 和脚掌厚度均出现大幅度下降。到造模后第 22
          8 000～10 000 Da）内，两端扎紧，以40 mL含1%聚山梨                 天，其 AI 和脚掌厚度均显著低于 CLT 组和模型组（P＜
          酯80的磷酸盐缓冲液（PBS）（pH＝7.4）为释放外液，在                      0.05）。由图5可知，模型组大鼠显示出严重而全面的关
          37 ℃水浴恒温振荡器（100 r/min）内释放，每份样品重                     节肿胀与关节变形；CLT组大鼠关节肿胀程度较模型组
          复 3 次实验。在 0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h 时分别           稍微减轻，但效果并不明显；CLT-AN组大鼠关节与脚掌
          取样1 mL，同时补充同温、同体积的释放外液。按“2.4”                       肿胀程度均较模型组显著改善（P＜0.05），其关节与脚
          项下方法测定释放样品中CLT的药物浓度，计算累积释                           掌形貌趋近于正常组大鼠。
          放量，并绘制释放曲线，结果见图 3。由图 3 可知：游离                        2.8.3  CLT-AN 对 AIA 大鼠血清中炎症因子水平的影
          CLT 在 24 h 内基本释放完全；CLT-AN 在 12 h 前属于快               响   造模后第22天，取各组大鼠血液，放置30 min后以
          速释放期，12 h后属于缓慢释放期，72 h内的累积释放量                       7 000 r/min离心10 min，收集血清样品，按照ELISA试剂
          达73.56%，具有明显的缓释特征。                                  盒说明书操作，检测血清中炎症因子 TNF-α 和 IL-1β 含


          ·2600·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 21                                 中国药房    2022年第33卷第21期
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