Page 31 - 《中国药房》2022年21期
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下降,气血不足,内脏功能下降,气血阴阳失衡。中医衰                          由长春库美生物科技有限公司合成,引物序列和扩增产
          老学说包括肾虚衰老说、脾胃虚弱衰老说、气虚血瘀衰                           物长度见表1。
                [5]
          老说等 。根据中医古籍记载,人参-茯苓药对是一种常                                  表1 PCR引物序列和扩增产物长度
          用的配伍组合,在古代抗衰老方剂中,人参和茯苓配伍                            基因            序列(5’→3’)               扩增产物长度/bp
          的比例排在第1位,二者配伍组合出现了146次                  [6—7] 。《神   TUB1          上游:CCAAGGGCTATTTACGTGGA    117
                                                                            下游:GGTGTAATGGCCTCTTGCAT
                                                  [8]
          农本草经》记载“人参主补五脏,久服轻身延年”。研究                           SOD1          上游:CCGAATCCGAGCCAACC       115
                                            [9]
          表明,茯苓具有安魂、养神、延年的作用 。目前关于人                                         下游:TAACGACGCTTCTGCCTACAA
                                                              CTT1          上游:TCATCACCCATACGCTTCT     118
          参、茯苓二者配伍抗衰老的相关研究较少,且作用机制
                                                                            下游:GGACATTTGTAACCCACATTCT
          尚不明确。基于此,本研究以酿酒酵母为衰老模型生                             GSH1          上游:GCTGTTCGTGCTTACAAGTGAC  118
          物,筛选人参-茯苓药对抗衰老的最佳配伍比例、给药浓                                         下游:ATGCCTCCAAATCCGTTCT
                                                              ATP1          上游:AACTGCTTTGCCTGTTATTGAA  115
          度和给药时间点,通过测定抗氧化酶活性,活性氧(reac‐
                                                                            下游:GCGGAACCGACACGAG
          tive oxygen species,ROS)、丙 二 醛(malondialdehyde,     MRS1          上游:ACCCTTCCATTTCTGTACCTC   118
          MDA)水平,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含                         下游:AAGTTTCCAGCCTTTATCCA
                                                              CDC19         上游:AGAAGAACCTCCATCATT      113
          量和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,
                                                                            下游:AGACTTGTGGTATTCGTA
          MMP),以及氧化应激与能量代谢相关基因mRNA表达
                                                             1.3 菌种
          水平,初探人参-茯苓药对抗衰老作用机制,以期为人参-
                                                                 本研究所用酿酒酵母BY4742购自武汉淼灵生物科
          茯苓药对治疗由衰老导致的疾病提供实验参考。
                                                             技有限公司。
          1 材料                                               2 方法
          1.1  主要仪器
                                                             2.1  人参-茯苓药对提取物的制备
              本研究所用主要仪器有 innova40 型全温振荡培养
                                                                 笔者查阅相关文献发现,人参、茯苓在临床上的常
          箱、Eppendorf AG型高速离心机(德国Eppendorf公司),                                                    [10―11]
                                                             用配伍比例为 1∶1、1∶2 和 1∶4(m/m,下同)            ,故本研
          AB135-S型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司),infinite          究设置人参、茯苓的配伍比例为1∶1、1∶2、2∶1、1∶4、4∶1。
          M200PRO型酶标仪(瑞士TECAN公司),SCIENTZ型超                   将人参、茯苓分别粉碎过 60 目筛后,按 1∶1、1∶2、2∶1、
          声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司),                           1∶4、4∶1 混匀备用,每份 50 g。取混匀后的药材粉末加
          CFX 型实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)仪(美国                       10 倍量水(mL/g,下同)煎煮 2 h,过滤;滤渣加 8 倍量水
          Bio Rad公司)。                                        煎煮 1.5 h,过滤;合并 2 次滤液,以 5 000 r/min 离心 10
          1.2  主要药品与试剂                                       min,取上清液,浓缩,烘干,即得不同配伍比例的人参-
              人参、茯苓购自吉林省长春市宏检大药房(批号分                         茯苓药对提取物(得率分别为 14.83%、11.03%、16.07%、
          别为20210326、20210415),经长春中医药大学中药鉴定                  7.74%、22.06%)。另外,同法制备人参、茯苓单味药材提
          教研室王哲副教授鉴定为真品;磷酸盐缓冲液(PBS)购                         取物,得率分别为28.36%、2.46%。
          自美国Hyclone公司(批号AC10257442);YPD液体培养                 2.2  酿酒酵母的培养及生长曲线绘制
          基、MTT、卡那霉素、酵母破壁酶、过氧化氢酶(catalase,                       将酿酒酵母以平板划线方式在 YPD 固体培养基上
          CAT)检测试剂盒、过氧化物酶(peroxidase,POD)检测试                 培养,于 28 ℃培养箱中倒置培养 48 h 活化。取活化后
          剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司(批号分别为                             的单菌落置于 5 mL YPD 液体培养基中(培养基中加入
          626J031、1015D052、325P0414、20201130、20210924、       50 mg/mL卡那霉素5 μL),于28 ℃、180 r/min培养箱中
          20211009);BCA 蛋白定量试剂盒、ROS 检测试剂盒、                   扩大培养,再进行二次扩大培养,使接种量为2% 。取
                                                                                                       [12]
          MDA检测试剂盒、MMP检测试剂盒均购自上海碧云天                          经二次扩大培养后的菌液,以 2% 的接种量接种于新的
          生 物 技 术 有 限 公 司(批 号 分 别 为 070721211011、            培养基中,置于 28 ℃、180 r/min 培养箱中培养,并将此
          061821211119、073120201113、020421210406);超氧化        时记为0 h(初始接种期),每隔4 h取样。孔板中加入不
          物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒、ATP            同培养时间的酿酒酵母菌液 30 μL,再加 420 μL 培养
          含量检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所(批号                           基,采用MTT法于600 nm波长处测定样品吸光度值,以
          分别为 20210830、20190708);总 RNA 提取试剂盒购自               培养时间为横坐标、吸光度值×稀释倍数为纵坐标绘制
          天根生化科技(北京)有限公司(批号W9113);RNA逆转                      生长曲线,以确认酿酒酵母进入衰老期的时间点。
                                         TM
                           ®
          录试剂盒、TB Green Premix Ex Taq 试剂盒均购自日                2.3 人参-茯苓药对最佳配伍比例和给药条件的筛选
          本Takara公司(批号分别为AK71647A、AJG1875A);目                2.3.1  最佳配伍比例的筛选           笔者参考文献[13]方法,
          标基因 TUB1、SOD1、CTT1、GSH1、ATP1、MRS1、CDC19            先将不同配伍比例的人参-茯苓药对提取物的给药浓度


          中国药房    2022年第33卷第21期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 21  ·2585·
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