Page 32 - 《中国药房》2022年21期
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设置为 180 μg/mL，给药时间点设置为第 16 h。取“2.2”                 法检测细胞内抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性及 MDA
          项下经二次扩大培养的酿酒酵母菌液，按 2% 的接种量                          水平。实验重复3次。
          接种于新的培养基中（此时开始计时，下同），培养至第                           2.4.4  酿酒酵母细胞内 ROS 水平的检测             取“2.4.1”项
          16 h 时，分为空白对照组和不同配伍比例（1∶1、1∶2、2∶                    下各组酿酒酵母菌液 50 μL，以 3 000 r/min 离心 5 min，
          1、1∶4、4∶1）的人参-茯苓药对提取物组，空白对照组加                       吸弃培养基；沉淀用PBS洗涤3次后，加入DCFH-DA染
          入等体积无菌水，给药组分别加入180 μg/mL不同配伍                        色液 500 μL，置于 28 ℃培养箱中孵育 30 min。离心弃
          比例的人参-茯苓药对提取物，继续培养至第96 h，取样；                        去染色液，以PBS洗涤细胞3次后，用500 μL PBS重悬，
          采用MTT法测定细胞吸光度值（吸光度值越大，表明细                           取100 μL重悬液加入荧光板中，采用荧光酶标仪检测各
          胞存活率越高），以筛选最佳配伍比例。实验重复3次。                           组细胞内ROS的水平。实验重复3次。
          2.3.2  最佳给药浓度的筛选           参考文献[14]方法，将给            2.5 酿酒酵母细胞内ATP含量及MMP的测定
          药时间点设置为第 16 h，人参-茯苓药对 1∶4 提取物（根                     2.5.1  ATP 含量的测定      取“2.4.1”项下各组酿酒酵母
          据“2.3.1”项下结果确定）的给药浓度设置为 100、140、                    菌液50 μL，以3 000 r/min离心5 min，吸弃培养基；沉淀
          180、220、260、300 μg/mL。取“2.2”项下经二次扩大培                用 PBS 洗涤 3 次后，加入酵母破壁酶，于 30 ℃孵育 2 h，
          养的酿酒酵母菌液，按 2% 的接种量接种于新的培养基                          再离心除去上清液，沉淀用 PBS 清洗 3 次；加入 200 μL
          中，培养至第16 h时，分为空白对照组和人参-茯苓药对                         裂解液涡旋 5 s，反复 3 次，于 4 ℃条件下以 12 000 r/min
          1∶4 提取物不同给药浓度组，空白对照组加入等体积无                          离心5 min，取上清液按照试剂盒说明书方法操作，检测
          菌水，给药组分别加入不同浓度的人参-茯苓药对1∶4提                          ATP含量。实验重复3次。
          取物，继续培养至第96 h，取样；采用MTT法测定细胞吸                        2.5.2  MMP的测定      取“2.4.1”项下各组酿酒酵母菌液
          光度值，以筛选最佳给药浓度。实验重复3次。                               50 μL，以 3 000 r/min 离心 5 min，吸弃培养基；沉淀用
          2.3.3  最佳给药时间点的筛选            选择“2.3.1”“2.3.2”项      PBS洗涤3次后，加入2 μmol/L罗丹明123溶液500 μL，
          下筛选出的最佳配伍比例和给药浓度，将给药时间点设                            于28 ℃培养箱中避光孵育30 min；离心除去上清液，沉
          置为第 16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88 h。       淀用 PBS 洗涤 3 次后，加入 500 μL PBS 重悬，采用流式
          取“2.2”项下经二次扩大培养的酿酒酵母菌液，按2%的                         细胞仪检测MMP。实验重复3次。
          接种量接种于新的培养基中，分为空白对照组和不同给                            2.6  酿酒酵母细胞内氧化应激与能量代谢相关基因
          药时间点组，然后分别培养至上述时间点时给药，继续                            mRNA表达水平的测定
          培养至第96 h，取样；采用MTT法测定细胞吸光度值，以                            取“2.4.1”项下各组酿酒酵母菌液5 mL，用Trizol法
          筛选最佳给药时间点。实验重复3次。                                   提取总 RNA，利用反转录试剂盒将总 RNA 反转录为
          2.4  酿酒酵母细胞内抗氧化酶活性及ROS、MDA水平                        cDNA，再以 cDNA 为模板，进行 PCR。PCR 反应体系
          的测定                                                （共25 μL）为SYBR 12.5 μL，DEPC水8 μL，cDNA模版
          2.4.1  分组及给药      取“2.2”项下经二次扩大培养的酿                 2.5 μL，上、下游引物各1 μL。反应条件为95 ℃预变性
          酒酵母菌液，按2%的接种量接种于新的培养基中，培养                           30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40
          至第 28 h 时，分为空白对照组、人参-茯苓药对 1∶4 提取                    个 循 环 。 以 TUB1 为 内 参 ，采 用 2     －△△Ct  法 定 量 分 析
          物组（220 μg/mL）、人参单药组（220 μg/mL）、茯苓单药                 SOD1、CTT1、GSH1、ATP1、MRS1、CDC19 mRNA 的表
          组（220 μg/mL）。空白对照组加入等体积无菌水，各给                       达水平。实验重复3次。
          药组分别加入相应药物，继续培养至第 96 h 后，取样进                        2.7  统计学方法
          行后续实验。                                                  数据采用 GraphPad Prism 9 软件进行统计分析，计
          2.4.2  粗酶液的制备        取“2.4.1”项下各组酿酒酵母菌              量资料均采用 x±s 表示。多组间比较采用单因素方差
          液 500 μL，以 3 000 r/min 离心 5 min，吸弃培养基；沉淀            分 析 ，组 间 两 两 比 较 采 用 LSD-t 检 验 。 检 验 水 准
          用 PBS 洗涤 3 次后，加入 500 μL PBS，置于冰水浴中超                 α＝0.05。
          声（功率300 W，工作9 s，间歇3 s，总时间为5 min）破碎，                 3 结果
          然后于4 ℃条件下以12 000 r/min离心10 min，取上清液                 3.1 酿酒酵母的生长曲线
         （即粗酶液），采用BCA法测定蛋白浓度后，于－20 ℃保                             由图 1 可知，第 0～4 h 时为酿酒酵母的迟滞期，第
          存备用。                                                4～16 h 时为对数生长期，16 h 以后进入稳定期，第 68 h
          2.4.3  酿酒酵母细胞内SOD、POD、CAT水平及MDA水                    时到达拐点，酿酒酵母开始进入衰老期，直至第 96 h 左
          平的检测      取“2.4.2”项下各组酿酒酵母细胞粗酶液适                    右酵母细胞数量趋于稳定，因此选择第96 h作为本实验
          量至 96 孔板中，每组设 3 个复孔，按照试剂盒说明书方                       的检测时间点。


          ·2586·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 21                                 中国药房    2022年第33卷第21期
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