Page 42 - 《中国药房》2022年20期
P. 42

2 方法                                                4 ℃下以 13 000 r/min 离心 20 min，取上清液，测定蛋白
          2.1 CCI模型的建立                                        浓度并于100 ℃下变性。取变性蛋白样品，进行电泳分
              所有小鼠适应性饲养 7 d 后，随机分为假手术组                        离并转移至聚偏二氟乙烯膜上，封闭后，分别加入
         （n＝16）和造模组（n＝48）。造模组小鼠术前禁食 12 h，                     VEGF、α7 nAChRs、β-actin 抗体（以含 3% 牛血清白蛋白
          腹腔麻醉，仰卧固定后行颈部备皮消毒，剪开颈部皮肤，                           的 TBST 缓冲液稀释，稀释比例分别为 1∶500、1∶300、
          暴露双侧颈总动脉（长度约1 cm），并在血管下垫玻璃纸                         1∶5 000），室温孵育10 min，4 ℃过夜；加入相应二抗（稀
          以保护周围组织。将体内血栓形成测定仪的刺激电极、                            释比例 1：10 000），室温孵育 1.5 h；用 TBST 缓冲液洗膜
          温度感受器钩于血管和玻璃纸之间，采用80 μA的温控                          6次，每次3 min，随后加ECL试剂反应3～5 min，胶片曝
          电流刺激动脉血管 7 min，若血管远端温度突然下降则                         光，显影 2 min，定影。使用 Total Lab Quant V11.5 版图
                                                [7]
          表明血管内血栓形成，即 CCI 模型复制成功 。然后缝                         像软件计算灰度值，以目标蛋白与内参（β-actin）的灰度
          合小鼠伤口，保温饲养，术后连续3 d肌内注射青霉素钠                          值比值为目标蛋白的表达水平。
          20万单位/d，以预防感染。取造模24 h后成功存活的小                        2.7  小鼠脑组织中 VEGF 和 α7 nAChRs mRNA 表达
          鼠（造模成功率100%）进行后续实验。假手术组小鼠按                          的检测
          上述方法操作，但不通电。                                            采用实时荧光定量 PCR 法进行检测。每组随机选
          2.2 分组与给药                                           取“2.4”项下冻存的 5 只小鼠的脑组织，采用 TRNzol 总
              将造模成功的CCI模型小鼠随机分为模型组、阿司                         RNA 提取试剂提取样本脑组织的总 RNA，测定 RNA 浓
          匹林组（阳性对照，10 mg/kg）、中药组（益气活血中药组                      度和纯度后进行 cDNA 反转录。以所得 cDNA 为模板，
          分，33 mg/kg），每组16只。除模型组和假手术组小鼠灌                      进行 PCR 扩增。反应体系如下：cDNA 模板适量（由 1
          胃水外，其余各组小鼠灌胃相应药液，每天 1 次，连续 8                        μg mRNA反转录所得），2×Master Mix 10 μL，10 μmol/L
          周。阿司匹林组和中药组的给药剂量均为临床等效剂                             的上/下游引物各 0.5 μL，加水至总体积为 18 μL。PCR
          量 [8―9] ，且前期实验已经证实该剂量是能引起（生物）等                      反应程序如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退
          效反应的相对药物剂量。                                         火延伸40 s，共40个循环。采用2           －ΔΔCt 法，以β-actin为内
          2.3  小鼠学习记忆能力的检测                                    参，计算目标基因的表达水平。各基因引物均由英杰生
              采用跳台实验检测各组小鼠的学习记忆能力。实                           工生物技术（北京）有限公司设计、合成，引物序列和产
          验前，将小鼠放入实验箱内，适应环境5 min并进行学习                         物大小见表1。
          测试；24 h 后，进行记忆能力测试，将小鼠放于平台上，                               表1   目标基因的引物序列和产物大小
          记录从放上平台至第1次跳下平台所需的时间（即跳台                            目标基因              引物序列（5′→3′）          产物大小/bp
          潜伏期）和5 min内跳下平台的次数（即跳台错误次数），                        VEGF        上游引物：ATCATGCGGATCAAACCTCACC  101
                                                                          下游引物：GGCTTTGTTCTGTCTTTCTTTGGTC
          以此作为学习记忆能力的评价指标。                                    α7 nAChRs   上游引物：CTGGCTTTGCTGGTATTCTTG   204
          2.4  小鼠脑组织样本的处理                                                 下游引物：CACAATCACTGTCACGACCACT
              跳台实验结束后，所有小鼠禁食12 h，于次日麻醉、                       β-actin     上游引物：CGTTGACATCCGTAAAGACCTC  159
                                                                          下游引物：ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG
          处死后快速取出完整脑组织，用预冷的生理盐水冲洗干
          净。每组随机取5只小鼠的左侧脑组织，剥离大脑皮层                            2.8  小鼠脑组织中VEGF、Ang1、bFGF含量的检测
          和海马组织，分别置于 4% 中性多聚甲醛溶液中保存；                              每组随机选取“2.4”项下冻存的5只小鼠的脑组织，
          剩余小鼠的脑组织以锡纸包裹并保存于液氮中，置                              严格按照 ELISA 试剂盒说明书操作，使用酶标仪于 450
          于－80 ℃冰箱中保存。                                        nm波长处检测脑组织中VEGF、Ang1、bFGF的含量。
          2.5  小鼠大脑皮层和海马组织中NVU超微形态结构的                         2.9 统计学方法
          观察                                                      采用SPSS 25.0软件进行统计分析。所有数据均用
              取“2.4”项下小鼠的大脑皮层和海马组织，分别用                        x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
          0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液冲洗 3 次，加入 1% 锇酸溶液于                  比 较 采 用 LSD-t 检 验 、Student-Newman-Keuls 检 验 或
          4 ℃下染色2 h，切块，脱水；然后放入100%树脂中，常规                      Tamhane’s T2检验。检验水准α＝0.05。
          包埋，切片（50 nm），于透射电镜下观察各组小鼠大脑皮                        3 结果
          层和海马组织中 NVU 的超微形态结构，并随机选取 10                        3.1  益气活血中药组分对模型小鼠学习记忆能力的
          个视野拍照。                                              影响
          2.6  小鼠脑组织中 VEGF 和 α7 nAChRs 蛋白表达的                      与假手术组比较，模型组小鼠跳台错误次数显著增
          检测                                                  多（P＜0.05），跳台潜伏期显著缩短（P＜0.05）。与模型
              采用Western blot法进行检测。每组随机选取“2.4”                 组比较，阿司匹林组和中药组小鼠跳台错误次数显著减
          项下冻存的5只小鼠的脑组织，经裂解、匀浆、静置后，于                          少（P＜0.05），中药组小鼠跳台潜伏期显著延长（P＜


          ·2468·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 20                                 中国药房    2022年第33卷第20期
   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47