Page 58 - 《中国药房》2022年19期
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80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，再进行传代培养和后续                        因的表达水平。
          实验。                                                 2.8 HepG2细胞中IκBα、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达检测
          2.3 HepG2细胞活力的检测                                        采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期细
              采用 CCK-8 法进行检测。取对数生长期 HepG2 细                   胞，按 2×10 个/孔接种于 6 孔板中，按“2.4”项下方法分
                                                                        5
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          胞，以 1×10 个/孔接种于 96 孔板中，然后分为对照组、                     组、造模与给药，每组设3个复孔。细胞培养24 h后，加
          模型组和GI不同浓度组（0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL，             入适量 RIPA 裂解液提取总蛋白，并置于冰上充分裂解
          浓度根据预实验结果设置），每组设3个复孔。参考文献                           30 min，于 4 ℃条件下以 12 000 r/min 离心 15 min，取上
          [12]方法，对照组加入含 1% 牛血清蛋白的培养基，模型                       清液采用 BCA 法测定蛋白浓度。蛋白经煮沸变性后，
          组加入含 0.5 mmol/L 游离脂肪酸（由油酸和棕榈酸按                      进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜；以5%
          2∶1 比例配制而成，以复制 NAFLD 细胞模型，下同）的                      脱脂奶粉封闭1.5 h，加入IκBα、NF-κB、p-NF-κB、β-actin
          培养基，给药组加入含相应浓度药物和0.5 mmol/L游离                       一抗（稀释度均为 1∶1 000），室温孵育 2.5 h；以 TBST 洗
          脂肪酸的培养基。培养24 h后，采用酶标仪测定各孔吸                          膜 3 次，每次 10 min，加入二抗（稀释度为 1∶6 000），室
          光度值，吸光度值越大，细胞活力越强。                                  温孵育1 h；以TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL化
          2.4 HepG2细胞脂滴形成情况观察                                 学发光试剂，采用全自动化学发光成像分析仪成像。采
              采 用 油 红 O 染 色 法 进 行 观 察 。 取 对 数 生 长 期           用Image J 6.0软件进行分析，以IκBα蛋白与内参β-actin
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          HepG2 细胞，以 2×10 个/孔接种于 6 孔板中，然后分为                   的灰度值比值表示 IκBα 蛋白的表达水平，以 p-NF-κB
          对照组、模型组和 GI 低、中、高浓度组（0.25、0.5、1                     蛋白与 NF-κB 蛋白的灰度值比值表示 NF-κB 蛋白的磷
          mg/mL，浓度根据“2.3”项下结果设置），每组设 3 个复                     酸化水平。

          孔。对照组加入含有 1% 牛血清蛋白的完全培养基，模                          2.9  统计学方法
          型组加入含有 0.5 mmol/L 游离脂肪酸的培养基，GI 低、                       采用 SPSS 25.0 软件对数据进行统计分析，结果以
          中、高浓度组加入含相应药物和0.5 mmol/L游离脂肪酸
                                                              x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
          的培养基。培养24 h后，各组细胞按油红O染色试剂盒                          比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          说明书方法操作，然后采用倒置显微镜观察并拍照。
                                                              3 结果
          2.5  HepG2细胞内TG含量的检测
                                                              3.1  GI对HepG2细胞活力的影响
              取对数生长期HepG2细胞，按“2.4”项下方法接种、
                                                                  与对照组比较，模型组 HepG2 细胞活力显著降低
          分组、造模与给药，每组设3个复孔。培养24 h后收集细
                                                             （P＜0.01）。与模型组比较，GI 不同浓度组 HepG2 细胞
          胞，采用超声破碎仪进行超声裂解，然后按照TG试剂盒
                                                              活力均显著升高（P＜0.01）。结果见表2。
          说明书方法操作，检测HepG2细胞内TG含量。
                                                               表2   各组HepG2细胞活力的测定结果（x±s，n＝＝3）
          2.6  HepG2细胞上清液中肝功能指标和炎症指标检测
                                                              组别                吸光度     组别            吸光度
              取对数生长期HepG2细胞，按“2.4”项下方法接种、                     对照组              1.01±0.02  GI 1 mg/ mL组  0.90±0.02 b
                                                              模型组              0.43±0.05 a  GI 2 mg/ mL组  0.88±0.07 b
          分组、造模与给药，每组设3个复孔。培养24 h后收集培
                                                              GI 0.25 mg/mL组   0.57±0.05 b  GI 4 mg/ mL组  0.89±0.15 b
          养基，以3 000 r/min离心15 min，取上清液，按试剂盒说                  GI 0.50 mg/mL组   0.86±0.06 b
          明书相关方法操作后，检测 AST、ALT、IL-1β、IL-6 和                      a：与对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01
          TNF-α水平。                                            3.2 GI对HepG2细胞脂滴形成的影响
          2.7  HepG2 细胞中 SREBP-1c、FAS mRNA 的表达水                   对照组 HepG2 细胞边缘清晰，细胞质丰富，细胞内
          平检测                                                 未见红色脂滴。模型组 HepG2 细胞内可见大量红色脂
              采用实时荧光定量 PCR 法进行检测。取对数生长                        滴，细胞核明显萎缩、体积变小。GI各浓度组HepG2细
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          期 HepG2 细胞，按 2×10 个/孔接种于 6 孔板中，按“2.4”               胞内红色脂滴均明显减少，细胞核萎缩不明显、体积大
          项下方法分组、造模与给药，每组设3个复孔。细胞培养                           小正常。结果见图1。
          24 h 后，提取总 RNA，然后根据逆转录试剂盒说明书方                       3.3 GI对HepG2细胞内TG含量的影响
          法，逆转录为 cDNA，再进行 PCR 扩增。PCR 反应条件                         与对照组比较，模型组 HepG2 细胞内 TG 含量显著
          为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性3 s，60 ℃退火30 s，共40               升高（P＜0.01）。与模型组比较，GI中、高浓度组HepG2
          个循环。以 β-actin 作为内参，采用 2         －ΔΔCt 法计算目的基        细胞内TG含量均显著降低（P＜0.01）。结果见表3。


          ·2356·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 19                                 中国药房    2022年第33卷第19期
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