Page 63 - 《中国药房》2022年19期
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mg BSA）；第5周起大鼠腹腔注射BSA 0.5 mg，每天增加                  法测定蛋白浓度。蛋白经变性后，进行十二烷基硫酸
          0.5 mg 直至 10.0 mg；第 6 周末大鼠尾静脉注射 LPS 100            钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，室温封闭2 h ，加入PI3K
          μg。假手术组大鼠麻醉后仅暴露左侧肾脏，不做切除，                         （稀释度为 1∶500）、p-PI3K（稀释度为 1∶300）、Akt（稀释
          其余步骤同造模组，皮下、腹腔均注射生理盐水。造模                           度为 1∶400）、p-Akt（稀释度为 1∶200）、p-GSK3β（稀释
          结束后，检测大鼠末次注射后 24 h 的尿蛋白，当造模大                       度为 1∶200）、GSK3β（稀释度为 1∶400）、FN（稀释度为
          鼠的尿蛋白水平为假手术组大鼠的3倍时，表明造模成                           1∶1 000）、β-actin（稀释度为 1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过
            [14]
          功 。本研究造模成功的大鼠共50只。                                 夜；加入二抗（稀释度为1∶5 000），室温孵育2 h；加入发
              将造模成功的 50 只大鼠按体质量分为模型组和                        光液进行曝光，经凝胶成像系统成像后，采用Image J软
          HRCHQ 高、中、低剂量组（4.05、2.03、1.02 g/kg）以及盐             件分析目的蛋白的灰度值，以 p-PI3K 与 PI3K、p-Akt 与
          酸贝那普利片组（阳性对照组，20 mg/kg），每组各10只。                    Akt、p-GSK3β 与 GSK3β 的灰度值比值分别表示 PI3K、
          各给药组剂量参考文献[9]设置。假手术组、模型组大鼠                         Akt、GSK3β 蛋白的磷酸化水平，以 FN 蛋白与内参 β-
          灌胃蒸馏水，其余各组大鼠灌胃相应药液，灌胃体积均                           actin蛋白的灰度值比值表示FN蛋白的表达水平。
          为15 mL/kg，每天1次，连续5周。                               2.7 统计学方法
          2.3 大鼠血清中总蛋白、白蛋白、尿素氮含量的测定                              采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资
              各组大鼠于末次给药后 1 h 麻醉，暴露腹主动脉后                      料以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间
          采血，静置15 min后，以2 500 r/min离心15 min，取上清              两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          液，按试剂盒说明书相关方法检测大鼠血清中总蛋白、                           3 结果
          白蛋白、尿素氮含量。                                         3.1  HRCHQ 对模型大鼠血清中总蛋白、白蛋白、尿素
          2.4  大鼠肾脏组织中 TGF-β1、TNF-α 蛋白表达水平的                  氮含量的影响
          检测                                                     与假手术组相比，模型组大鼠血清中总蛋白、白蛋
              采用免疫组织化学染色法进行检测。各组大鼠腹                          白含量均显著降低，尿素氮含量显著升高（P＜0.01）。
          主动脉采血后，摘取右侧肾脏，将肾脏的一半置于                             与模型组相比，盐酸贝那普利片组、HRCHQ高剂量组大
          －80 ℃下冷冻保存，另一半固定于4％多聚甲醛中。取                         鼠血清中总蛋白、白蛋白含量均显著升高，尿素氮含量
          固定于 4％多聚甲醛中的肾脏（每组取 6 只），常规制备                       均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），HRCHQ 中剂量组大
          厚度为5 µm的石蜡切片，经脱蜡、脱水后，以3％过氧化                        鼠 血 清 中 白 蛋 白 含 量 显 著 升 高（P＜0.05）。 结 果
          氢灭活内源性过氧化物酶 10 min；将切片浸入 0.01                      见表1。
          mol/L 枸橼酸盐溶液（pH 6.0）中加热至沸腾，冷却至室                    表1   各组大鼠血清中总蛋白、白蛋白、尿素氮含量的测
          温后，以 5％BSA 封闭 25 min；加入 TGF-β1、TNF-α 一抗                 定结果（x±s，n＝10）
         （稀释度均为 1∶100），4 ℃孵育过夜；滴加二抗（稀释                        组别             总蛋白/（μg/mL）  白蛋白/（g/L）  尿素氮/（mmol/L）
                                                              假手术组           54.43±4.87  32.40±1.40  5.87±0.93
          度为 1∶2 000），37 ℃孵育35 min；经二氨基联苯胺显色                  模型组            32.38±9.10 a  24.25±0.86 a  10.82±2.11 a
          后，以苏木素复染，再脱水、透明、封片。每组大鼠各取                           HRCHQ高剂量组      46.97±8.05 b  31.74±5.55 c  7.17±1.51 b
          10 张连续切片，每张切片随机选取 5 个不同的视野，于                        HRCHQ中剂量组      40.83±13.89  30.13±5.20 b  9.66±3.32
                                                              HRCHQ低剂量组      38.68±14.85  27.71±6.30  9.91±3.63
          光学显微镜下观察TGF-β1、TNF-α蛋白的表达情况。以
                                                              盐酸贝那普利片组       48.03±4.181 c  31.11±3.18 c  6.37±3.67 c
          细胞内表达棕黄色颗粒为阳性染色。采用 JEOA 801D
                                                                a：与假手术组相比，P＜0.01；b：与模型组相比，P＜0.05；c：与模型
          形态学图像分析系统计算阳性染色的光密度值，用来表                           组相比，P＜0.01
          示蛋白的表达水平。                                          3.2  HRCHQ 对模型大鼠肾脏组织中 TGF-β1、TNF-α
          2.5  大鼠肾脏组织中补体C3的表达水平检测                            蛋白表达的影响
              采用免疫荧光法进行检测。取“2.4”项下经 0.01                         与假手术组相比，模型组大鼠肾脏组织中有大量
          mol/L枸橼酸盐溶液（pH 6.0）煮沸并冷却至室温的切片，                    TGF-β1、TNF-α 蛋白表达，其光密度值均显著升高（P＜
          以 5％BSA 封闭 30 min，加入补体 C3 一抗（稀释度为                  0.05）；与模型组相比，HRCHQ高剂量组、盐酸贝那普利
          1∶500），4 ℃孵育过夜；滴加二抗（稀释度为 1∶1 000），                 片组大鼠肾脏组织中有少量 TGF-β1、TNF-α 蛋白表达，
          37 ℃避光孵育 30 min；弃去抗体，避光，于显微镜下观                     其光密度值均显著降低（P＜0.05）。结果见图1、表2。
          察，拍照，并用 Image J 软件检测荧光强度，用来表示蛋                     3.3 HRCHQ对模型大鼠肾脏组织中补体C3表达的影响
          白表达水平。                                                 与假手术组相比，模型组大鼠肾小球系膜区补体C3
          2.6  大鼠肾脏组织中 PI3K/Akt/GSK3β 信号通路相关                 沉积显著增加，其荧光强度值显著升高（P＜0.05）；与模
          蛋白磷酸化水平和FN表达水平的检测                                  型组相比，HRCHQ高剂量组、盐酸贝那普利片组大鼠肾
              采用Western blot法进行检测。每组选取“2.4”项下                小球系膜区补体 C3 沉积显著减少，其荧光强度值均显
          冷冻保存的 5 个肾脏组织，以 RIPA 裂解提取蛋白，BCA                    著降低（P＜0.05）。结果见图2、表2。


          中国药房    2022年第33卷第19期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 19  ·2361·
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