Page 57 - 《中国药房》2022年19期
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非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病（non-alcoholic fatty liver    J210033、J200012），油红 O 试剂盒（北京索莱宝科技有
          disease，NAFLD）是一种临床病理综合征。随着人们生                     限公司，批号 20210426），三酰甘油（triglyceride，TG）试
          活水平的提高，NAFLD的发病率也大幅增加，据2019年                       剂盒（南京建成科技有限公司，批号 20210612），丙氨酸
                                                       [1]
          流行病学数据统计，NAFLD 的全球患病率高达 25% 。                      转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒、天冬氨
          脂质积累作为 NAFLD 的主要特征，通常出现在疾病发                        酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒、小
          展的早期，其引起的炎症反应也是 NAFLD 的另一个主                        鼠 IL-1β 试剂盒、小鼠 IL-6 试剂盒、小鼠 TNF-α 试剂盒
          要特征   [2―3] 。脂肪在肝脏的过度累积可活化核因子κB抑                  （江苏酶免实业有限公司，批号分别为 MM-44625M1、
          制蛋白 α（nuclear factor-κB inhibitory protein α，IκBα），  MM-44115M1、 MM-0039M1、 MM-0163M1、 MM-
          激活 NF-κB 信号通路，促进肿瘤坏死因子 α（tumor                     0132M1），棕榈酸、油酸（美国 Sigma 公司，批号分别为
          necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素 1β（interleukin-     101298301、1011202365），RNA提取试剂盒、逆转录试剂
                                                       [4]
          1β，IL-1β）和 IL-6 等炎症因子的释放，从而产生炎症 。                  盒、cDNA 扩增试剂盒（日本 TaKaRa 公司，批号分别为
          脂质积累及其引起的炎症反应若在疾病早期及时干预                            AL40413A、AL50948A、AL61810A），兔源 IκBα 多克隆
          是可以逆转的，但如果不进行干预，后期可能发展为肝                           抗体、兔源 NF-κB 多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）
                                             [5]
          硬化或肝癌，严重危及患者生命健康 。目前治疗                             标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗（武汉三鹰生
          NAFLD 主要依靠药物或者机体的自身调节作用，但药                         物 技 术 有 限 公 司 ，批 号 分 别 为 00095768、00086772、
          物副作用较大且患者依从性较差 。因此，有必要寻找                           20000311），兔源磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）多克隆抗体
                                      [6]
          新的治疗NAFLD的药物。                                     （美国 Cell Signaling 公司，批号 17）。β-肌动蛋白（β-
              龙胆为龙胆科植物条叶龙胆 Gentiana manshurica               actin）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、固醇
          Kitag.、龙胆 G. scabra Bge.、三花龙胆 G. triflora Pall. 或  调节元件结合蛋白 1c（sterol regulatory element binding
          坚龙胆 G. rigescens Franch. 的干燥根及根茎，具有清热              protein 1c，SREBP-1c）的 PCR 引物由生工生物工程（上
          燥湿、泻肝胆火的功效，临床上含有龙胆的方剂主要用                           海）股份有限公司合成，引物序列与扩增产物长度
          于保肝，且疗效较好        [7―8] 。环烯醚萜苷类化合物为龙胆               见表1。
          的主要成分，具有多种药理活性，如保肝、降脂、抗炎和                                  表1   PCR引物序列及扩增产物长度
          利胆作用    [9―10] 。但是，龙胆环烯醚萜类成分（gentian                引物名称        引物序列（5′→3′）                 产物长度/bp
                                                              β-actin     上游引物：CCACCATGTACCCTGGCATT     189
          iridoids ，GI）是否可改善NAFLD尚不明确。基于此，本                               下游引物：CGGACTCGTCATACTCCTGC
          研究首先以 D101 大孔树脂柱分离 GI，然后以游离脂肪                       FAS         上游引物：GCTGCGGAAACTTCAGGAAAT    84
                                                                          下游引物：AGAGACGTGTCACTCCTGGACTT
          酸诱导的人肝癌 HepG2 细胞为 NAFLD 细胞模型 ，初
                                                    [11]
                                                              SREBP-1c    上游引物：GTGAGCCTGACAAGCAATCA     103
          步 探 讨 GI 对 NAFLD 的 改 善 作 用 及 机 制 ，以 期 为                         下游引物：GGTGCCTACAGAGCAAGAG
          NAFLD治疗药物的开发提供参考。                                  1.3  细胞
          1 材料                                                   人肝癌 HepG2 细胞购自中国科学院生物化学与细
          1.1  主要仪器                                          胞生物学研究所。
              本研究所用主要仪器有 TM3 型二氧化碳细胞培养                       2 方法
          箱、Multiscan MK3 型酶标仪、QuantStudio   TM  5 型实时荧      2.1  GI的提取
          光定量聚合酶链式反应（PCR）仪、IBright FL1000 型智                     称取龙胆药材 3.0 kg，加水煎煮 2 次（2 次水和药材
          能凝胶成像系统（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），           的质量比分别为10∶1、8∶1），每次1.5 h。合并2次滤液，
          810R型离心机（德国Eppendrof公司），Discovery V20型             浓缩成质量浓度为 1.2 g/mL 的溶液（以生药量计）。将
          倒置荧光显微镜（德国 Zeiss 公司），Mini Protean 型蛋白              上述浓缩液加水稀释成质量浓度为 0.1 g/mL 的样品溶
          电泳仪（美国Bio-Rad公司）。                                  液，加入 D101 大孔树脂柱中，以 30% 乙醇进行洗脱纯
          1.2  药品与试剂                                         化，收集洗脱液；将洗脱液于 60 ℃下减压蒸馏浓缩，蒸
              龙胆药材购自吉林省北药药材加工有限公司（批号                         干，即得 GI（得率为 7%，其中龙胆苦苷的含量为 54.6
          ldzc3-20171017-2），经长春中医药大学药学院翁丽丽教                  mg/g）。
          授鉴定为龙胆 G. scabra Bge. 的干燥根及根茎。其他药                  2.2 细胞培养
          品与试剂有胎牛血清（以色列 BI 公司，批号 2120140），                       将HepG2细胞接种于含10%胎牛血清、1%青霉素/
          DMEM 培养基（美国 Gibco 公司，批号 8121342），胰蛋                链霉素的 DMEM 培养基（以下简称“培养基”）中，于
          白酶、青链霉素双抗（美国 HyClone 公司，批号分别为                      37 ℃、5% CO2 细胞培养箱中培养。当细胞融合度达


          中国药房    2022年第33卷第19期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 19  ·2355·
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