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行HPD-600大孔吸附树脂吸附，吸附饱和后以3倍柱体                         组、卡格列净片组（阳性对照组，15 μmol/L）、新疆鼠尾
          积水洗脱（流速1 mL/min），然后以3倍柱体积的40%乙                      草酚酸纯化物组（10.8 μg/mL）、丹参素组（50 μmol/L）、
          醇洗脱（流速0.67 mL/min），收集洗脱液后浓缩蒸干，即                     原儿茶醛组（50 μmol/L）、咖啡酸组（50 μmol/L）及迷迭
          得新疆鼠尾草酚酸纯化物（得率为67.6%）。经紫外分光                         香酸组（50 μmol/L），每组设置3个复孔。新疆鼠尾草酚
          光度法测定，纯化物中总酚酸含量为 60.80%；经高效液                        酸纯化物浓度根据预实验结果设置，各单体成分浓度依
          相色谱紫外检测法测定，纯化物中丹参素、原儿茶醛、咖                           据“2.3”项下毒性作用考察结果设置。除对照组外，模型
          啡酸、迷迭香酸 4 个酚酸类单体成分的含量分别为                            组和各给药组均加入 500 μmol/L 棕榈酸和 30 mmol/L
                                  [9]
          0.35%、0.17%、0.31%、5.36% 。                           葡萄糖处理48 h（造模条件根据前期预实验结果设置），
          2.2 HK-2细胞的培养                                       复制高糖高脂损伤细胞模型。加入培养基或药物培养
              将 HK-2 细胞复苏后，培养于含 10% 胎牛血清、1%                   48 h，然后用0.25%胰蛋白酶消化细胞，然后以1 500 r/min
          双抗的 MEM 完全培养基中，并将细胞置于 37 ℃、                         离心5 min（下同），弃去上清液；用2 mL PBS清洗细胞3
          5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养。待到细                           遍，离心，弃去上清液。加入 100 μL 1×Binding Buffer
          胞长至80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行                       重悬细胞，每管加入 5 μL Annnexin Ⅴ-FITC 和 5 μL 碘
          传代培养。取对数生长期的HK-2细胞进行后续实验。                           化丙啶（propidium iodide，PI），室温避光孵育 25 min，加
          2.3  新疆鼠尾草酚酸纯化物及单体成分对正常细胞的                          入 400 μL 1×Binding Buffer，在 1 h 内用流式细胞仪检
          毒性作用考察                                              测细胞凋亡率。
              采用 CCK-8 法进行测定。将处于对数生长期的
                                                              2.6  新疆鼠尾草酚酸纯化物及单体成分对模型细胞中
                          4
          HK-2 细胞以 8×10 个/mL 的密度接种于 96 孔板中，每
                                                              氧化应激指标的影响
          孔 100 μL。根据预实验结果，将细胞分为对照组（培养
                                                                  采用吸光光度法进行测定。细胞分组和处理同
          基）、不同质量浓度（10、20、40、80、160、320 μg/mL）的新
                                                             “2.5”项下。按照各指标试剂盒说明书方法操作，分别检
          疆鼠尾草酚酸纯化物组和不同浓度（25、50、100、200、
                                                              测各组细胞中MDA、GSH含量及SOD活性。
          400 μmol/L）的丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和迷迭香酸
                                                              2.7  新疆鼠尾草酚酸纯化物及单体成分对模型细胞中
          组，每组设置3个复孔；并设置不加细胞的空白孔。加入
                                                              Keap1/Nrf2通路相关蛋白表达的影响
          培养基或药物培养 48 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 溶
                                                                  采用 Western blot 法进行检测。将对数生长期的
          液，37 ℃放置2 h。采用酶标仪于450 nm波长处测定各
                                                              HK-2细胞以1×10 个/mL的密度接种于6孔板中，每孔
                                                                              5
          孔的光密度（OD），并计算细胞存活率，以评价各药物对
                                                              2 mL。常规孵育24 h后，将细胞分为对照组、模型组、卡
          正常细胞的毒性。细胞存活率（%）＝[（给药孔 OD－空
                                                              格列净片组（阳性对照组，15 μmol/L）、新疆鼠尾草酚酸
          白孔 OD）/（对照孔 OD－空白孔 OD）]×100%。实验重
                                                              纯化物组（10.8 μg/mL）和迷迭香酸组（50 μmol/L，浓度
          复3次。
                                                              依据“2.3”项下毒性作用考察结果设置），每组设置 3 个
          2.4  新疆鼠尾草酚酸纯化物对模型细胞存活率的影响
                                                              复孔。除对照组外，模型组和给药组均加入500 μmol/L
              采用 CCK-8 法测定不同浓度新疆鼠尾草酚酸纯化
                                                              棕榈酸和 30 mmol/L 葡萄糖处理 48 h，复制高糖高脂损
          物对高糖高脂损伤细胞存活率的影响。将处于对数生
          长期的HK-2细胞以8×10 个/mL的密度接种于96孔板                       伤细胞模型。造模后，加入培养基或药物培养48 h。采
                                 4
                                                              用 RIPA 裂解法抽提细胞中总蛋白，并采用 BCA 蛋白浓
          中，每孔100 μL。根据预实验结果，将细胞分为对照组、
          模型组、不同质量浓度（0.15、0.3、0.9、2.7、5.4、10.8、21.6           度检测试剂盒测定总蛋白浓度。将总蛋白高温变性处
          μg/mL）新疆鼠尾草酚酸纯化物干预组，每组设置3个复                         理后，行 SDS-PAGE 电泳（分离胶电压 80 V、30 min，浓
          孔；并设置不加细胞的空白孔。除对照组外，模型组和                            缩胶电压 120 V、60 min）分离，转至 PVDF 膜（电流 300
          各给药组均加入 500 μmol/L 棕榈酸和 30 mmol/L 葡萄                mA，转膜时间 50～55 min）；以 TBST 缓冲液清洗 15
          糖处理48 h（造模条件根据前期预实验结果设置），复制                         min×3次，加入Keap1（稀释比例1∶5 000）、Nrf2（稀释比
          高糖高脂损伤细胞模型。造模后，加入培养基或药物培                            例1∶1 000）、HO-1（稀释比例1∶1 500）、NQO1（稀释比例
          养48 h，再按“2.3”项下方法计算细胞存活率。                           1∶1 000）、β-actin（稀释比例 1∶2 500）一抗，4 ℃孵育过
          2.5  新疆鼠尾草酚酸纯化物及单体成分对模型细胞凋                          夜；用 1×TBST 清洗 15 min×3 次，加入二抗（稀释比例
          亡的影响                                                均为1∶2 000），室温孵育1 h。以化学发光凝胶成像系统
              采用 AnnexinV-FITC/PI 染色法进行测定。将对数                 成像后，采用Image J 1.8.0软件测定条带灰度值，以目标
                                   5
          生长期的 HK-2 细胞以 1×10 个/mL 的密度接种于 6 孔                  蛋白与内参 β-actin 条带灰度值的比值表示目标蛋白的
          板中，每孔2 mL。孵育24 h后，将细胞分为对照组、模型                       表达水平。实验重复3次。


          ·2350·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 19                                 中国药房    2022年第33卷第19期
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