Page 42 - 《中国药房》2022年19期

“2.3.1”项下方法分组与给药，索拉非尼的给药浓度为3、 2.7 G6PD调控肝癌细胞对索拉非尼耐药的机制考察
10、30 μmol/L，干预时间为 24 h，然后检测细胞存活率。 2.7.1 Huh7-SR 细胞中 PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表
上述实验重复3次。 达的检测 采用Western blot法进行检测。将Huh7细胞
2.4.2 索拉非尼对 Huh7-SR 细胞凋亡水平的影响 采 与 Huh7-SR 细胞按“2.3.2”项下方法培养，然后检测 2 种
用流式细胞术进行检测。将Huh7细胞和Huh7-SR细胞 细胞中 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白的表达，以 p-PI3K
按“2.3.3”项下方法分组与给药，索拉非尼的给药浓度为 与 PI3K、p-Akt 与 Akt 的灰度值比值分别表示 PI3K、Akt
6 μmol/L，干预时间为24 h，然后检测细胞总凋亡率。上 蛋白的磷酸化水平。上述实验重复3次。
述实验重复3次。 2.7.2 G6PD抑制剂对Huh7-SR细胞中PI3K/Akt信号通
2.5 G6PD对Huh7-SR细胞索拉非尼敏感性的影响 路相关蛋白表达的影响 采用 Western blot 法进行检
2.5.1 G6PD 在 Huh7-SR 细 胞 中 的 表 达 水 平 采 用 测。将 Huh7-SR 细胞分为对照组（无药物干预）和 6AN
Western blot法进行检测。将Huh7细胞和Huh7-SR细胞 组（20 μmol/L），6AN 的干预时间为 48 h，然后按“2.7.1”
按“2.3.2”项下方法培养，不用药干预，直接检测2种细胞 项下方法检测细胞中PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平。上
中 G6PD 的表达水平（以 G6PD 蛋白与内参 β-actin 灰度 述实验重复3次。
值的比值表示G6PD的表达水平）。上述实验重复3次。
2.7.3 G6PD过表达对细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋
2.5.2 G6PD抑制剂对Huh7-SR细胞活力的影响 采用
白 表 达 的 影 响 采 用 Western blot 法 进 行 检 测 。 将
CCK-8 法进行检测。将 Huh7-SR 细胞按“2.3.1”项下方
Huh7-G6PD 细胞和 Huh7-CT 细胞按“2.3.2”项下方法培
法分组与给药，6AN的给药浓度为1、3、10、30、100、300、
养，然后按“2.7.1”项下方法检测2种细胞中PI3K、Akt蛋
1 000 μmol/L（浓度根据预实验结果设置），干预时间为 白的磷酸化水平。上述实验重复3次。
24 h。上述实验重复 3 次。采用在线计算工具（https：//
2.8 统计学方法
www.aatbio.com/tools/ic50-calculator），计算半数抑制浓
采用 GraphPad Prism 8.0、SPSS 25.0 对数据进行统
度（IC50 ）值。
计学分析，计数资料以x±s表示。多组间比较采用单因
2.5.3 G6PD抑制剂对Huh7-SR细胞的耐药逆转作用考
察 采用 CCK-8 法进行检测。将 Huh7-SR 细胞分为对 素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
α＝0.05。
照组（无药物干预）、索拉非尼组（2 μmol/L）、索拉非尼+
6AN组（索拉非尼2 μmol/L+6AN 20 μmol/L），各组给药 3 结果
3.1 Huh7-SR细胞对索拉非尼耐药性的考察结果
浓度根据“2.5.2”项下结果和预实验结果设置，干预时间
为48 h，然后按“2.3.1”项下方法培养后测定各组细胞存 在索拉非尼干预下，与 Huh7 细胞相比，Huh7-SR 细
活率。上述实验重复3次。 胞存活率显著升高（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低
2.6 G6PD过表达对Huh7细胞索拉非尼敏感性的影响 （P＜0.05），由此表明，相比于 Huh7 细胞，Huh7-SR 细胞
2.6.1 G6PD过表达对Huh7细胞活力的影响 取G6PD 对索拉非尼的耐药性增强。结果见图1。
稳 定 过 表 达 的 肝 癌 细 胞 Huh7-G6PD 及 其 对 照 细 胞 3.2 G6PD对Huh7-SR细胞索拉非尼敏感性的影响结果
Huh7-CT，按“2.3.1”项下方法分组与给药，索拉非尼的 如图2A所示，与Huh7细胞比较，G6PD在Huh7-SR
干预浓度为 3、10、30 μmol/L，干预时间为 24 h，然后测 细胞中的表达水平显著升高（P＜0.05）。CCK-8 结果显
定细胞存活率。上述实验重复3次。 示，在 Huh7-SR 细胞中，单用索拉非尼干预后细胞存活
2.6.2 G6PD 过表达对 Huh7 细胞凋亡水平的影响 采 率无明显变化，表明该细胞对索拉非尼耐药；而经G6PD
用流式细胞术进行检测。取G6PD稳定过表达的肝癌细 抑制剂 6AN（IC50为 47.89 μmol/L）和索拉非尼联合干预
胞Huh7-G6PD及其对照细胞Huh7-CT，按“2.3.3”项下方 后 ，Huh7-SR 细 胞 存 活 率 显 著 降 低（P＜0.01），表 明
法培养后测定细胞凋亡率，索拉非尼的干预浓度为 6 G6PD 抑制剂可恢复 Huh7-SR 细胞对索拉非尼的敏感
μmol/L，干预时间为24 h。上述实验重复6次。 性，逆转索拉非尼耐药。结果见图2B、图2C。
Huh7细胞 Huh7-SR细胞
100 a 10 7 10 7 40
Huh7细胞 10 6 10 6
80 Huh7-SR细胞 10 5 10 5 30 a
细胞存活率/％ 60 a a PI 10 4 3 10 4 3 细胞凋亡率/％ 20
40
10
10
10
20
10
0 10 2 1 10 2 1 0
10
2
3
1
1
5
4
3
4
5
2
3 10 30 10 10 10 10 10 10 6 10 7.2 10 10 10 10 10 10 6 10 7.2 Huh7 Huh7-SR
索拉非尼/（μmol/L） FITC 细胞 细胞
A.细胞存活率的检测结果 B.细胞流式散点图 C.细胞凋亡率的检测结果
a：与Huh7细胞比较，P＜0.05
图1 Huh7-SR细胞对索拉非尼耐药性的考察结果
·2340· China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 19 中国药房 2022年第33卷第19期