Page 41 - 《中国药房》2022年19期
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准用于手术不能切除的晚期 HCC 的一线治疗，成为                          CO2恒温培养箱中培养。每隔2 d换液1次，当细胞生长
          HCC 治疗的重大突破 ，但随之产生的耐药问题给肝癌                         融合度为 80%～90% 时进行细胞传代。Huh7-G6PD 细
                            [3]
                             [4]
          治疗带来了巨大的挑战 。因此，阐明HCC索拉非尼耐药                         胞及其对照细胞 Huh7-CT 均培养于含 2 μg/mL 盐酸嘌
          的机制及寻找HCC治疗的新靶点将具有重要临床意义。                          呤霉素的培养基中，其他条件与Huh7细胞相同。
              葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydro‐       2.2 索拉非尼耐药肝癌细胞的构建
          genase，G6PD）是磷酸戊糖途径的限速酶和关键酶，可促                         采用间歇梯度浓度法构建索拉非尼耐药肝癌细胞
          进磷酸戊糖代谢产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷                            Huh7-SR：将Huh7细胞按“2.1”项下方法培养，当细胞融
          酸而平衡氧化应激水平，且其高表达与多种恶性肿瘤                            合度为 60%～70% 时，加入含索拉非尼的培养基（索拉
         （如肾细胞癌、肺癌等）的进展密切相关                 [5―7] 。相关研究      非尼浓度从2 μmol/L开始设置，后续每稳定1次则增加
          还发现，G6PD 可促进非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌等                        1 μmol/L），间隔 12 h 观察 1 次，当细胞融合度为 80%～
          对顺铂、紫杉醇及厄洛替尼产生耐药                 [8―10] ，因此，抑制     95% 时进行细胞传代。不断重复以上步骤直至细胞在
          G6PD 可增强抗肿瘤药物对耐药细胞的毒性作用。目                          含特定浓度的索拉非尼培养基中稳定生长。本研究构
          前，有关 G6PD 在 HCC 索拉非尼耐药中的作用未见报                      建的 Huh7-SR 细胞可在索拉非尼浓度为 6 μmol/L 的培
          道。基于此，本研究将探讨G6PD在HCC索拉非尼耐药                         养基中稳定生长，故后续用此浓度来维持Huh7-SR细胞
          中的作用机制，以期为寻找逆转 HCC 索拉非尼耐药的                         的耐药性。
          潜在靶点提供理论依据。                                        2.3 实验方法与技术
          1 材料                                               2.3.1  CCK-8 法检测细胞活力         将对数生长期细胞以
                                                                  3
          1.1 主要仪器                                           5×10 个/孔接种于96孔板中，培养24 h后，将细胞分为
              本研究所用主要仪器包括BB150型细胞培养箱（美                       空白孔（含培养基，不含细胞、药物）、对照孔（含培养基、
          国 Thermo Fisher Scientific 公司）、5424R 型低温离心机        细胞，不含药物）及药物干预孔（含培养基、细胞、药物），
         （德国 Eppendorf 公司）、J2-MC 型高速冷冻离心机[贝克                 平行设置3个复孔。各组细胞加或不加药物干预后，弃
          曼库尔特商贸（中国）有限公司]、BD_Accuri_C6 型流式                   培养基，每孔加入 CCK-8 试剂，孵育 1 h 后，采用酶标仪
          细胞仪（美国BD公司）、Epoch 2t型全波长酶标仪（美国                     测定各孔光密度（optical density，OD）值，并计算细胞存
          BioTek 有限公司）、Tannon 5200 型化学发光成像系统                 活率或抑制率，其中细胞存活率＝[（药物干预孔 OD
         （上海天能科技有限公司）。                                       值－空白孔 OD 值）/（对照孔 OD 值－空白孔 OD 值）]×
          1.2  主要药品与试剂                                       100%，药物抑制率＝1－细胞存活率。
              索拉非尼、G6PD 抑制剂 6-氨基烟酰胺（6-amino-                 2.3.2  Western blot 法检测蛋白表达水平        将对数生长
          nicotinamide，6AN）、盐酸嘌呤霉素、CCK-8 试剂盒购自               期细胞铺于6 cm培养皿，待细胞生长至60%时，加或不
          美 国 MCE 公 司（批 号 分 别 为 83807、87547、87126、           加药物干预后，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞后保存
          100266）；Annexin V FITC Apop Dtec Kit I 购自美国 BD     于－80 ℃备用。冰上解冻细胞，加入含蛋白酶抑制剂和
          公司（批号0076884）；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养                     磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解液提取总蛋白，并采用 BCA
          基 购 自 美 国 Gibco 公 司（批 号 分 别 为 2148169CP、           法检测总蛋白浓度。将总蛋白变性后，取 30 μg 总蛋白
          8121521、2462637）；ECL发光试剂盒购自苏州新赛美生                  在 10% 分离胶中进行 90 V 恒压电泳，随后 300 mA 恒流
          物技术有限公司（批号 P10300）；兔源蛋白激酶 B（pro‐                   转膜 80 min；封闭液封闭 10 min、TBST 洗涤 10 min，分
          tein kinase B，Akt）、磷酸化 Akt（phosphorylated Akt，p-   别加入相应一抗，于4 ℃孵育过夜，TBST洗涤10 min×
          Akt）、磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶（phosphoinositide 3-kinase，    3 次；加入二抗室温孵育 60 min，TBST 洗涤 10 min×3
          PI3K）、G6PD抗体和小鼠源β-肌动蛋白（β-actin）抗体均                 次；以 ECL 发光试剂显色，并于化学发光成像系统中显
          购自美国 CST 公司（货号分别为 4685S、4060S、4257S、               影，采用Image J软件测定蛋白灰度值，以目的蛋白与磷
          12263S、58169S）；兔 源 磷 酸 化 PI3K（phosphorylated       酸化蛋白或内参蛋白的灰度值比值表示蛋白磷酸化水
          PI3K，p-PI3K）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔免                   平或表达水平。
          疫球蛋白 G 和 HRP 标记的羊抗鼠免疫球蛋白 G 均购自                     2.3.3  流式细胞术检测细胞凋亡水平               将对数生长期
                                                                         5
          上海爱必信生物科技有限公司（货号分别为abs130869、                      细胞以 2×10 个/孔接种于 6 孔板中，加药干预后，以胰
          abs20002ss、abs20039ss）。                            酶消化细胞，离心，收集细胞；细胞以PBS洗涤3次后，重
          1.3  细胞                                            悬于 100 μL 的 BD binding buffer 中，转移至流式管中，
              人肝癌细胞Huh7购自中国科学院化学与细胞生物                        加入 Annexin Ⅴ FITC 和碘化吡啶（iodide pyridine，PI）
          学研究所。G6PD 稳定过表达的肝癌细胞 Huh7-G6PD                     各5 μL，避光孵育15 min。采用流式细胞仪检测细胞的
          及其对照细胞Huh7-CT购自上海和元生物技术有限公司。                       早期、晚期凋亡率，并计算总凋亡率（总凋亡率＝早期凋
          2 方法                                               亡率+晚期凋亡率）。
          2.1  细胞培养                                          2.4 Huh7-SR细胞对索拉非尼耐药性的考察
              Huh7细胞培养于含1%青霉素-链霉素、10%胎牛血清                    2.4.1  索拉非尼对 Huh7-SR 细胞活力的影响               采用
          的DMEM 培养基中（以下简称“培养基”），置于37 ℃、5%                    CCK-8 法进行检测。将 Huh7 细胞和 Huh7-SR 细胞按


          中国药房    2022年第33卷第19期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 19  ·2339·
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